耐冷菌的適冷分子機制及在污水處理中的應用

申秋華，王曉杰

(海軍勤務學院 海防工程系軍港勤務教研室，天津 300450)

1 引言

隨著經濟發展和人口增長，城市生活污水年排放量迅速增加，水環境中污染物排放數量及處理難度逐漸加大。這些污染物質大量排入天然水體，消耗水中的溶解氧，引起水質惡化。因此，研究如何高效地處理城市生活污水是當前函待解決的首要問題。生活污水處理技術存在物理法、化學法、生物法之分。憑借自身無二次污染、效果好、成本低廉等優勢，生物技術成為污水處理的主要手段[1～3]。國內城市生活污水處理方面，以生物處理技術為主，其處理系統主要是依賴具有降解活性的中溫菌，當這種菌處于20～25 ℃溫度區間時，可釋放較強生物活性與降解活性[4～6]。若環境溫度在10 ℃以下，絕大多數中溫菌代謝功能減弱，甚至失活而死亡。我國北方區域冬季溫度低，各大城市全年中月氣溫均值低于10 ℃的月份達6個[7，8]。從環境溫度來看，冬季的低溫對以中溫菌為主的污水處理設備造成劇烈的影響，很大程度地減弱了其對有機污染物的去除效果，使得出水難以達標排放。為提升低溫環境下污水處理效率，目前工程中主要采用降低污泥的處理壓力、對污水施以一定保溫處理、提高污泥濃度等措施[9～11]。這些措施雖在一定程度上能提高污水處理效率，但是大大增加了投資和運行費用，并未能從根本上解決低溫帶來的不利影響。

污水處理工程實踐表明，當溫度降低至10℃左右時，活性污泥中的大多數中溫菌的生長受到抑制，但是仍有少數的耐冷微生物可以存活下來，存活下來的耐冷菌能夠正常的代謝生長，并在污水處理中起著重要的作用。因此，要解決低溫生活污水達標排放問題，有效的方法是篩選出能高效降解生活污水中有機污染物的耐冷微生物。因此，從根本上根除低溫污水處理不佳的難題，有效途徑是從活性污泥中分離篩選具有較高降解活性的耐冷菌。

2 耐冷菌的分類

對于微生物分布與代謝活動，溫度是發揮著主要作用的一個環境因素。基于耐低溫能力的區別，可將微生物劃分成下述三類：低溫微生物、中溫微生物和高溫微生物[6，12]。低溫微生物的種類很多，包括真細菌、藍細菌、酵母菌以及一部分單細胞藻類。根據Morito的定義，將低溫微生物分為嗜冷菌和耐冷菌兩類。嗜冷菌的生長繁殖的溫度可低于0 ℃，其最適宜的溫度應在15 ℃以下，若溫度超過20 ℃，其無法生長繁殖；耐冷菌可生長繁殖的溫度為0～5 ℃，生長最適宜的溫度大于15 ℃，當溫度超過20 ℃時，其依然可生長繁殖[6]。

耐冷菌對于一定范圍內的溫度波動具有較強的忍受能力，就在地球上的分布而言，相比嗜冷菌，耐冷菌的分布更具廣泛性，自常溫環境至低溫環境皆能夠分離得到耐冷菌[13～17]。現已自諸多低溫環境，諸如淡水、冷凍食物、海水、冰川與高山的土壤等，分離到了各種類型的耐冷菌[18,19]。

已發現的耐冷菌主要有細菌、古菌、酵母菌、真菌、霉菌及藻類等。其中，細菌的數量和種類最多，并且以革蘭氏陽性菌占主導。從極地和海洋分離到的耐冷菌是優勢菌群，一些代表性的耐冷菌，見表1。

表1 耐冷菌的主要種屬

目前已發現的耐冷菌主要包括：鞘氨醇單胞菌屬，假單胞菌屬，生絲單胞菌屬，微球菌屬，動性球菌屬，鹽桿菌屬，弧菌屬，節桿菌屬，假交替單胞菌屬，嗜冷桿菌屬和鹽單胞菌屬等[4，20]。

3 耐冷菌的耐冷機制

溫度對于任何生物來說，都是一個非常重要的環境因子。耐冷菌在長期的生物進化過程中，已形成了適應低溫環境的特殊細胞結構和酶代謝機制。耐冷菌在長期的進化過程中，細胞內的細胞器結構以及酶的種類與結構均有別于中溫菌，形成了一套與低溫相適應的適冷分子機制。隨著基因分析技術的發展，其耐冷機制可以從細胞膜結構、低溫酶、蛋白質合成以及冷休克蛋白等幾方面解釋。

3.1 細胞膜結構

細胞膜在細胞同外部環境開展生命活動方面發揮著關鍵作用。耐冷菌通過對細胞膜內脂類的構成進行調節，從而實現對膜結構與流動性的有效調節，使得細胞正常生理機能得以維持[8，21]。低溫條件下細胞膜流動性和結構的變化，能夠保證其正常發揮吸收營養物質和電子轉移等功能。當處于低溫環境時，耐冷菌細胞內的不飽和脂肪酸含量升高，進而是脂類熔化點下降，此結構的變化對細胞膜流動性的保持有利[22，23]。諸如，Canillac等把3株中溫菌、Psychrotrophs與Psychiophiles的Arthrobacter菌株，分別培養在各自最適宜生長溫度以下的環境中，獲得以下結果：3株菌的細胞膜含不飽和脂肪酸量皆上升[22]。眾多研究證實，導致不飽和脂肪酸水平改變的原因主要為，飽和酶的引入導致脂肪酸的鏈長以及甲基支鏈發生改變。革蘭氏陰性菌通過改變脂肪酸飽和度和甲基鏈長度，而革蘭氏陽性菌更多是改變甲基鍵的類型和數目，這些變化對于低溫時維持細胞膜的流動性具有重要意義。

3.2 低溫酶

耐冷菌通常不會以產生孢子等休眠體的形式來抵御低溫時的“冷脅迫”，而是通過酶含量改變，對酶濃度以及酶種類進行調節，由此定量與定性地對低溫所致影響進行補償[19，22]。低溫酶是耐冷菌能夠長期在低溫環境下生存尤為重要的一個因素，它能夠使得酶促反應在低溫條件下進行。研究證實，當處于低溫時，耐冷菌的酶活力除了有所增強，其分泌能力也有所提升。雖然在低于最適生長溫度的條件下，耐冷菌的代謝速率減慢，但其仍能表現出更高的生化活力和更高的酶產出量。眾多研究結果顯示，耐冷菌的最高酶產生量出現在溫度遠低于其最適宜生長溫度的環境中。

低溫酶分子通常具備較高柔性，當處于低溫環境時會快速調整自身構象，其活性中心更易于接受與釋放底物，由此確保催化反應的成功實施[22]。例如，Narinx等從南極海水中2株不同的枯草桿菌中分離出兩種蛋白酶，與中溫菌蛋白酶的多肽鏈相比，這兩株低溫枯草桿菌的蛋白酶多肽鏈稍長。研究證實，此兩類酶含二硫橋結構，同時，此結構使酶分子內基團間相互作用下降，酶與溶劑分子間相互作用提高，低溫酶由此可具備較高柔韌性，同底物結合幾率更高[19，22，24]。但是，低溫酶的熱穩定性較低，隨著環境溫度升高，低溫酶容易發生去折疊結構變化，使酶的活性中心失去活性，且低溫酶發生錯誤折疊的幾率更高[8,9]。

3.3 蛋白質合成

耐冷菌在低溫環境中約10%～15%的細胞內蛋白質經是由調節機制合成。在影響細胞蛋白質合成方面，溫度的作用機制是調控核糖體上蛋白質或某類特異mRNA的翻譯速率[19，22，24，25]。高溫菌、中溫菌的蛋白質存在冷不穩定的特性，其活性與溫度正向相關，而耐冷菌的蛋白質處于低溫時結構完整性與催化活性卻無明顯變化，因此表現出非常高的催化能力[6，22]。實驗證實，耐冷菌處于低溫時，最不易發生體外蛋白質翻譯錯誤。比如，Szer等發現，當條件相同時，在蛋白質合成錯配率方面，適冷性的假單孢桿菌低于中溫菌。可見，低溫時耐冷菌擁有有效啟動的特殊功能，高溫菌與中溫菌則無此特殊功能。

研究證實，在耐冷菌的核糖體內能夠提取得到一類在0 ℃時具有翻譯能力的蛋白質，此類蛋白能夠使大腸桿菌的核糖低于0 ℃時翻譯Poly U聚合酶[4，22，24，26]。對于低溫環境，中溫菌的核糖體缺乏適應性，同時低溫還會導致其細胞膜受損，造成細胞溶解而死亡。故0℃低溫條件時，眾多中溫菌皆無法合成蛋白質。

3.4 冷休克蛋白

冷休克蛋白也稱為冷激蛋白，它是通過耐冷菌的自身調節機制產生。冷休克蛋白最初是在大腸桿菌中發現的，總共發現了9種冷休克蛋白，分別命名為CspA～CspI。它是一類由68～74個氨基酸構成的小分子蛋白質，在核酸結合區都包含有兩個一致的保守RNA結合基序。冷休克蛋白對于微生物低溫耐受至關重要，其與RNA結合改變其二級結構，從而影響DNA復制以及轉錄和翻譯等冷適應調節過程。當受到冷刺激時，微生物可生成冷休克蛋白這種關鍵性應激蛋白，此蛋白在低溫時對維持耐冷菌的生理活性起著十分重要的作用[8，22，27]。在環境溫度出現快速、大幅度降低等波動的情況下，耐冷菌會產生一種適應溫差的冷休克反應，細胞內瞬時大量誘導分泌高達幾十倍的冷休克蛋白。例如，Fujii等研究發現，對大腸桿菌進行冷誘導反應，溫度從37 ℃下降到10 ℃后，CspA的濃度在1～1.5 h就能夠達到100 μmol/L，并隨后誘導產生多種冷休克蛋白。此外，通過探究耐冷酵母Trichos-poronpullulans的冷休克反應，Julseth等發現，當生長溫度從21 ℃下降至5 ℃時，此耐冷酵母12 h內即可誘導合成26類冷休克蛋白[10，22]。

細胞通過產生冷休克蛋白來應對外界溫度的變化，產生蛋白數量與溫度降低的劇烈程度成正比關系。實際上，中溫菌、耐冷菌以及嗜熱菌在低溫刺激時都會產生冷休克蛋白，只是這種調節機制在耐冷菌細胞內體現的更加明顯。例如，Ray在自南極分離出的耐冷菌細胞內發現，冷休克基因在高溫和低溫時都可以正常表達，只是當溫度由高溫降低至5 ℃以下低溫時，CspA 表達量大大增加。

耐冷菌通過調控在細胞膜、酶分子、蛋白質層面上精細的構成與結構變化，使低溫時自身正常代謝活動與繁殖能力得以維持。耐冷菌的此適冷性的生物特征，決定了自身可高效降解低溫污水中所含的污染物。探究耐冷菌的冷適應機理，能夠為此類菌廣泛應用于污水處理方面予以提供堅實的理論支撐。

4 耐冷菌在污水處理中的應用與展望

在微生物篩選技術快速發展背景下，借助耐冷菌可高效降解低溫污水內污染物的獨特優勢，可顯著擴寬其在環境工程特別是污水處理方面的應用范圍[8]。通過引入篩選低溫環境下的耐冷菌的措施，來克服低溫對污水處理廠所帶來的不利影響。國內外對耐冷菌在污水處理領域的應用已經進行了大量的研究。目前，耐冷菌在降解污水中的氮和磷、石油烴類、氯酚類、脂肪類等物質領域已經取得了很好的效果。國外對耐冷菌的研究起步比較早，比如，早在1974年，Westlake和Atlas等就從極地環境中分離到了能夠降解原油的耐冷菌株。我國對耐冷菌的篩選與研究工作開始于20世紀90年代初。目前，我國已經從多種低溫環境中分離出了大量耐冷菌，并且在耐冷菌的分子鑒定與技術培養等方面取得了一定的研究成果。

在生活污水處理系統中，國內外學者主要是研究在寒冷氣候條件下耐冷菌對氮、磷和COD污染物的去除情況。城市生活污水處理大多選擇生物處理方法，環境溫度對此處理系統的效率具有較大影響，在實際工程運行過程中，若生化池的污水溫度在10 ℃以下時，大多存在微生物生長停滯以及降解活性下降的現象[13]。原因主要在于，低溫時中溫菌細胞內代謝生成的酶親和底物分子能力大大下降，酶催化活性減弱，生理代謝能力也隨之下降。通過投加具有高效降解活性的耐冷菌，可有效克服低溫對生活污水處理所帶來的不利影響[28]。例如，李亞選等[19]于冬季自我國東北區域某污水處理廠二沉池的活性污泥內，分離出對有機污染物具有高效降解作用的耐冷菌。通過實驗研究發現，當污水溫度在10 ℃以下時，耐冷菌成為活性污泥中的優勢菌群。低溫時，耐冷菌對COD去除率相比中溫菌對COD去除率高出63.67%；中溫時，兩者對COD去除率相差在10%以下，由此可見，耐冷菌在我國寒冷地區生活污水處理方面具有良好的應用前景。另外有研究發現，采用耐冷性的復合菌群處理低溫生活污水比單一菌具有更高的COD去除率。學者姜安璽等[29]于冬季的市政下水道的污泥內提取得到4類耐冷菌，同時針對單菌與混合菌開展了有機物降解的對比實驗。實驗結果表明混合菌的對COD去除率高達72%，明顯高于各單菌的去除率，節約了工程投資成本，從而證明耐冷菌在寒冷地區生活污水治理領域具有廣闊的應用前景。

污水所含氮與磷污染物是造成水體富營養化的關鍵因素之一，這兩類物質的去除對我國污水處理與生態平衡的維持發揮著非常關鍵的作用。大量研究發現，低溫會使細菌的生物活性和生長速率大大降低，使得氮和磷的去除變得更加困難。經研究，張雷等[30]發現，借助低溫馴化培養技術與微生物固定化技術構建的耐冷硝化菌群，可實現污水60%的氨氮去除率。固定化微生物技術能夠提高低溫污水的脫氮效率，克服懸浮態微生物流失問題。唐雙[31]從天然冷水體中篩選得到3株優勢耐冷菌Pseudomonas koreensis YB1、Pseudomonas fragi YB2、Pseudomonas lundensis YB3。后續采用吸附法和包埋法對混合耐冷菌進行固定化處理，與游離的混合耐冷菌相比，固定化的混合耐冷菌比單一菌株明顯提高了低溫污水的處理效率，且利用新型聚氨酯固定化材料包埋混合菌株可使污水中 COD、NH3-N去除率超過90%，TP 去除率超過60%。

5 結語

耐冷菌及其相關代謝產物的研究以及它們在污水處理工程中的潛在價值逐漸引起人們的廣泛關注，并成為新的研究熱點。國內外從低溫環境下篩選出的耐冷菌株在污水處理中的效果也非常顯著，但離實際的污水工藝的應用還有一定差距。究其主要原因是目前對于耐冷菌的研究大多局限于一種或者少數幾種菌株，而實際污水是一個復雜的環境體系，需要數量和種類較多的優勢菌株共同起作用。總之，國內外學者對耐冷菌的研究和菌株開發上處在摸索階段，也缺乏一定的研究深度。因此，研究利用這些在低溫環境中已分離到的耐冷微生物降解污水中的各種有機污染物，這對污水治理工作起很重要的作用。