基于網絡藥理學研究黃芪-白術治療新冠肺炎的作用機制

涂文玲，朱景茹，李墨辭，陳梅妹，楊朝陽，甘慧娟*

（1.福建中醫藥大學中醫證研究基地，福建 福州350122；2.福建省2011中醫健康管理協同創新中心，福建 福州350122；3.福建省中醫健康狀態辨識重點實驗室，福建 福州350122）

爆發于2019年的新型冠狀病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，NCP，下稱“新冠肺炎”）屬于急性呼吸道傳染病，傳染性強，部分感染者癥狀不明顯或者無癥狀，但是變化速度快。國家衛健委將新冠肺炎納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施［1］。自《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》開始將中醫藥治療納入治療方案，中醫藥全程參與了NCP的防治，發揮著重要作用，彰顯了中醫藥的優勢［2］。有研究發現，新冠肺炎患者淋巴細胞和白細胞計數減少，免疫功能下降是發病重要原因之一［3］。中醫認為免疫力即是“正氣”，正因為體內正氣（免疫力）虛弱才會導致發病，因此應從益氣補肺、扶正固本來進行治療。董競成教授團隊近日發布新冠肺炎治療方中用黃芪-白術以顧護正氣［4］。黃芪甘微溫，歸肺、脾經，具有補氣升陽、益衛固表等功效；白術甘苦溫，歸脾、胃經，具有健脾益氣、固表止汗等功效。兩者與防風同用，可益氣固表，祛邪止汗，治療虛人外感。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》和《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，黃芪-白術被應用于恢復期肺脾氣虛型NCP患者，且在北京、江西、湖北、浙江等省推出的NPC預防方案中常被使用［5］。馬麗娟等［6］基于數據挖掘和關聯規則分析得出黃芪-白術是治療新冠肺炎的高頻藥對?，F代藥理表明黃芪-白術在機體中均能不同程度地改善免疫力和機體免疫反應性［7］，但是其作用機制仍不完整，因此有必要采用網絡藥理學的方法進一步探討黃芪-白術治療新冠肺炎的作用機制。

1 方 法

1.1 黃芪-白術有效活性成分收集與篩選 采用中藥系統藥理學平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］，在“herbname”檢索框中分別以“黃芪”“白術”為檢索詞進行檢索，收集黃芪、白術的活性成分信息。以口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為篩選依據，篩選出黃芪-白術的活性成分信息。

1.2 黃芪-白術作用靶點信息獲取 采用TCMSP數據庫對篩選出的黃芪-白術的活性成分進行蛋白靶標獲取，然后利用UniProt數據庫中UniProtKB檢索功能對蛋白靶標進行逐一檢索，并在檢索結果中將物種限定為“human”，對蛋白靶標進行一一對應的基因名稱轉換，獲取黃芪-白術有效活性成分的作用靶點。

1.3 新冠肺炎作用靶點獲取 以“novel coronavirus pneumonia”為檢索詞，在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）進行檢索，獲取新冠肺 炎 作用靶點。利用Venny2.1.0在線工具，獲得黃芪-白術與新冠肺炎共同作用靶點，即是黃芪-白術治療新冠肺炎的作用靶點。

1.4 網絡的構建與分析 把黃芪-白術的單味藥有效活性成分信息和有效活性成分-作用靶點信息導入Cytoscape軟件（版本：3.7.2），繪制出單味藥有效活性成分網絡和有效活性成分-作用靶點網絡，再選擇“Merge”功能將兩者合并成黃芪-白術的有效活性成分-作用靶點網絡。將共同作用靶點導入到String數據庫（https：//string-db.org/）“Multipleproteins”檢索框中，蛋白種類設置為“homosapiens”，其他參數為默認設置，構建黃芪-白術與新冠肺炎共同作用靶點之間的相互作用網絡（PPI網絡），并對PPI網絡進行分析。

1.5 GO和KEGG富集分析 對共同作用靶點進行GO和KEGG富集分析。先下載R軟件，在R軟件中進行下載并安裝Bioconductor網站中的相關插件，包含“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”5個插件；安裝完成后用R軟件進行GO和KEGG富集分析。

2 結 果

2.1 黃芪-白術作用靶點 通過TCMSP數據庫收集、篩選（OB≥30%、DL≥0.18）出黃芪-白術活性成分27個，其中黃芪20個、白術7個。剔除未找到蛋白靶標的活性成分，獲得19個有效活性成分（其中白術與黃芪有一個相同的活性成分），其中黃芪16個、白術4個，見表1。篩選出的有效活性成分包含槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、蛇床子素（hederagenin）、毛蕊異黃酮（calycosin）等。對所有獲取的蛋白靶標進行基因名轉換后，去除重復項，共獲得189個作用靶點。將篩選、轉化后的單味藥、有效活性成分及作用靶點導入Cytoscape軟件（3.7.2版本）構建黃芪-白術有效活性成分-作用靶點網絡，見圖1。該網絡包含210個節點，其中圓形節點為單味藥，共2個；菱形節點為有效活性成分，共19個；六邊形節點為作用靶點，共189個。

表1 黃芪-白術有效活性成分

2.2 黃芪-白術治療新冠肺炎的作用靶點 通過GeneCards數據庫檢索得到新冠肺炎作用靶點259個，將黃芪-白術的作用靶點和新冠肺炎的作用靶點分別輸入Venny2.1.0在線工具分析，得到共同作用靶點41個，包括前列腺素-內過氧化物合酶2（PTGS2）、二肽基肽酶4（DPP4）、一氧化氮合酶2（NOS2）、前列腺素-內過氧化物合酶1（PTGS1）、鈣調蛋白1（CALM1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、絲裂原激活的蛋白激酶14（MAPK14）、RELA原癌基因（RELA）、白細胞介素-4（IL-4）、BCL2細胞凋亡調節劑（BCL2）、凋亡調節劑（BAX）、半胱天冬酶3（CASP3）、絲裂原激活的蛋白激酶8（MAPK8）、信號轉導和轉錄激活子1（STAT1）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、細胞間黏附分子1（ICAM1）、表皮生長因子受體（EGFR）、BCL2凋亡調節劑（BCL2L1）、Fos原癌基因（FOS）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）、RB轉錄核心加壓因子1（RB1）、白細胞介素-6（IL-6）、半胱天冬酶8（CASP8）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、蛋白激酶CAlpha（PRKCA）、熱休克蛋白家族A（Hsp70）成員5（HSPA5）、白細胞介素-1β（IL-1β）、CCMotif趨化因子配體2（CCL2）、蛋白激酶CBeta（PRKCB）、一氧化氮合酶3（NOS3）、熱休克蛋白家族B（HSPB1）、白細胞介素-2（IL-2）、絲氨酸（SERPINE1）、白細胞介素-1A（IL-1A）、聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）、CXC主題趨化因子配體11（CXCL11）、CXC基序趨化因子配體2（CXCL2）、C反應蛋白（CRP）、CXC基序趨化因子配體10（CXCL10）、CD40配體（CD40LG）、干擾素調節因子1（IRF1）。

圖1 黃芪-白術有效活性成分-作用靶點網絡圖

2.3 PPI網絡構建與分析 將41個共同作用靶點輸入到String數據庫，構建出這41個共同作用靶點的相互作用網絡模型，見圖2。該網絡包含41個節點（即共同作用靶點），430條節點連接線（連接線表示兩個節點之間存在相互作用，粗細代表相互作用關系的強弱）。該網絡平均度值為21（度值指某一個節點與其他節點的連接數，度值越大，連接的節點數越多），其中IL-6、MAPK8、CASP3、MAPK1、CCL2、ICAM1、IL-1B、IL-4、MAPK14、PTGS2、RELA、FOS、EGFR、IL-2、CASP8、HMOX1、BCL2L1、NOS2、PPARG、STAT1、CXCL10和NOS3的度值高于平均度值，即為相對核心靶點。

圖2 共同作用靶點互作（PPI）網絡圖

2.4 GO富集分析 通過R軟件進行GO生物學過程富集分析，獲得P＜0.05的GO條目84個，結果表明黃芪-白術治療新冠肺炎過程主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結合等生物學過程，做出前二十名GO富集氣泡圖，見圖3。越紅代表富集程度越高，P值越小。

2.5 KEGG富集分析 通過R軟件進行KEGG信號通路富集分析，根據P＜0.05篩選到151條信號通路，涉及到的信號通路類型主要有病毒感染（人類免疫缺陷病毒1感染、eb病毒感染等）、癌癥（小細胞肺癌、肝細胞癌等）、信號傳導（IL-17信號、TNF信號、MAPK信號、P53信號、HIF-1信號、VEGF信號、B細胞和T細胞信號等）等，見表2。

3 討 論

通過對黃芪-白術活性成分、作用靶點查找與篩選，得到19個有效活性成分，包含槲皮素、山奈酚、蛇床子素、毛蕊異黃酮等。槲皮素具有抗氧化、抗炎、增強免疫等作用［9-10］，能明顯增加淋巴細胞轉化率和T淋巴細胞數目［11］；山奈酚具有抗氧化、抗炎、調節免疫等多種生物學功能［12-13］，能有效抑制MAPK通路降低白介素8等炎癥因子產生，且能明顯提高T淋巴細胞的增殖能力，抑制胸腺細胞凋亡與巨噬細胞吞噬［14］；蛇床子素長期應用于皮膚瘙癢、濕疹等皮膚類疾病，愈來愈多研究表明蛇床子素具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、抗癌等生物學功能［15-16］，彭建明等研究表明蛇床子素能有效促進激活肺癌細胞H1299中促凋亡因子Bax來抑制NF-kB信號通路，誘導肺癌細胞凋亡［17］；毛蕊異黃酮是一種具有抗氧化、抗炎、抗癌和免疫調節功能的單體活性成分［18-20］。由此可見，黃芪-白術治療新冠肺炎是通過這些活性成分起到抗炎、抗氧化及調節免疫的作用。

圖3 前二十名GO富集分析氣泡圖

表2 KEGG富集分析結果（基因數排名前十）

通過對PPI網路分析得出22個相對核心靶點。白介素中的IL-6、IL-1β、IL-4、IL-2是調控范圍最為廣泛的細胞因子，在免疫系統中發揮著重要作用［21］，其中IL-6可以誘導B淋巴細胞增殖、分化和分泌抗體，也可以促進T淋巴細胞的增殖和激活從而參與機體的抗感染免疫和自身免疫。IL-1B是典型的促炎性細胞因子，炎性信號可通過激活炎癥小體而刺激分泌IL-1B，少量的IL-1B可產生適當的炎癥應答從而激活特異性免疫反應，起到免疫監視作用［22］，IL-4具有抗炎效應，可與具有促炎效應的細胞因子發生拮抗作用，對于巨噬細胞、T細胞等免疫細胞具有較大影響［23］。IL-2可促進細胞和體液免疫應答，對機體清除細胞內感染的病原體有積極的作用［24］，另外有研究顯示：相對核心靶點中的CCL2對T、B淋巴細胞具有強大的趨化活性，從而調節機體自身免疫［25］和CASP3在凋亡、抗炎過程中起到重要作用［26］。

通過GO富集分析可知，黃芪-白術對新冠肺炎的治療作用主要通過參與以下生物學過程而發揮療效：細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結合等生物學過程。進一步的KEGG富集分析提示黃芪-白術主要通過調控IL-17、P53、HIF-1、B細胞、T細胞等多種信號通路而達到治療新冠肺炎的作用。研究表明：IL-17是致炎性細胞因子，與許多炎癥性疾病和癌癥的易感性相關［27］，在抗感染、炎癥與自身免疫病的發生中起重要作用［28］；P53信號通路能夠對肺結核進行免疫調控作用［29］；HIF-1參與缺氧代償反應、免疫反應、新生血管的生成與調節等［30］，與系統性紅斑狼瘡等自身免疫疾病密切相關；B細胞主要代表體液免疫，由造血干細胞發育而來［31］，主要產生抗體；T細胞是一類控制體內免疫反應性細胞群，在維持機體免疫系統、調節免疫方面具有重要作用［32］。

綜合有效活性成分、靶點基因、GO和KEGG富集分析，可表明黃芪-白術主要是通過抗炎、抗氧化及調節免疫作用以達到治療新冠肺炎的目的。