壯骨健膝方含藥血清對經IL-1β誘導的大鼠膝關節退變軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路抑制因子蛋白表達的影響

郭潔梅，陳秀明，陳 鵬，肖 艷，毛 驍，蘇友新*

（1.福建衛生職業技術學院，福建 福州350101；2.福建中醫藥大學，福建 福州350122；3.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州350003）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關節軟骨退變、滑膜炎癥為主要病理改變的退行性疾病。已有研究表明Wnt/β-catenin信號通路的激活與軟骨退變的發生、發展密切相關［1］。課題組前期對大鼠膝關節軟骨細胞的體外研究也證實，經白細胞介素-1β（IL-1β）誘導的退變軟骨細胞可抑制Ⅱ型膠原蛋白的表達水平，并伴有β-catenin蛋白表達增多，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）mRNA表達減少［2］，提示經IL-1β誘導的退變軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路被激活。課題組針對KOA的臨床效驗方—壯骨健膝方能提高經IL-1β誘導的退變軟骨細胞Ⅱ型膠原蛋白的表達，降低β-catenin蛋白的表達，提高GSK-3βmRNA的表達［3］，表明該方可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活起到保護關節軟骨的作用。Dickkopf相關蛋白1（Dkk-1）、分泌型卷曲相關蛋白3（sFRP-3）是Wnt/β-catenin信號通路活動的抑制因子［4-5］。本實驗通過壯骨健膝方含藥血清對經IL-1β誘導的大鼠膝關節退變軟骨細胞進行干預，觀察不同時間段Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平的變化，探討壯骨健膝方是否通過調控Dkk-1、sFRP-3這兩個蛋白的表達水平，抑制Wnt/β-catenin信號通路被激活，進一步研究壯骨健膝方保護關節軟骨的可能分子機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物40只清潔級2周齡SD大鼠，雌雄各半，用于血清的制備；5只清潔級2周齡雄性SD大鼠，用于體外生長良好的第三代軟骨細胞的取材。大鼠均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2007-0005。大鼠在福建中醫藥大學動物實驗中心飼養，動物環境合格證號：SCXK（閩）2009-0001。實驗前均適應性喂養1周。

1.2 主要試劑及儀器0.25%胰蛋白酶、低糖DMEM培養基、10%胎牛血清（美國Hyelone公司）；Dkk-1抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；sFRP-3抗體（美國R&D公司）；青霉素-鏈霉素溶液（美國Thermo Scientific公司）；內參β-actin、蛋白濃度檢測試劑盒、Western Blot檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；凝膠成像系統、BIO-TEKELX 800型全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

2 實驗方法

2.1 壯骨健膝方藥液制備 壯骨健膝方由桑寄生15 g，骨碎補15 g，川牛膝15 g，杜仲9 g，獨活9 g，土鱉蟲6 g，生地黃15 g，秦艽9 g，鹿銜草10 g，腫節風10 g組成，均購于福建中醫藥大學國醫堂。制備方法：中藥首煎用500 mL冷水浸泡20 min后，用武火煮沸后轉為文火再煮20 min；次煎再加水500 mL，武火煮沸后轉文火再煮30 min；將2次煎得的藥液混合，采用旋轉蒸發儀濃縮成含生藥1 g/mL的藥液，用玻璃瓶密封，置于4℃冰箱保存備用。

2.2 大鼠含藥血清、空白血清制備 采用隨機數字表法將40只清潔級2周齡SD大鼠取20只，按人和大鼠體表面積換算法計算，予9.84 mL/（kg·d）壯骨健膝方藥液灌胃，其余20只予等體積生理鹽水灌胃，每日2次，連續灌胃5 d。于末次灌胃3 h后于大鼠腹主動脈采血，2 500 rpm離心25 min，分離血清，于56℃水浴滅活30 min，過濾，分裝，分別為大鼠含藥血清與空白血清，置于-20℃冰箱保存備用。

2.3 模型制備和分組

2.3.1 大鼠膝關節軟骨細胞的分離、原代及傳代培養 選取5只清潔級2周齡大鼠，采用10%水合氯醛麻醉后脫頸處死，取雙膝關節面軟骨并清除殘留組織，將軟骨小塊剪至1 mm3大小，加0.2%Ⅱ型膠原酶3 mL，置37℃培養箱中進行消化，每2 h取1次上清液；懸浮液離心后收集軟骨細胞，共分離收集3次；收集到的軟骨細胞用含10%胎牛血清（FBS）及青霉素-鏈霉素溶液各100 U/mL的培養液重懸，調整細胞懸液濃度為3×105個/mL，后接種于25 cm2細胞培養瓶中；倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞生長情況，每2～3 d更換1次培養液，待軟骨細胞鋪滿培養瓶底部80%后，進行傳代培養。

2.3.2 模型制備及分組 取第三代生長良好的軟骨細胞按2.5×105個/mL的密度接種在2塊六孔板中，采用含10 ng/mL IL-1β的10% FBS/DMEM培養基干預24 h后，隨機取3孔，依據課題組前期研究已形成的經IL-1β誘導的退變軟骨細胞制備方法［2］進行模型鑒定。模型成功鑒定標準：在倒置顯微鏡下軟骨細胞形態顯示為成纖維樣、長梭形，胞漿間隙變大，可見脂滴；經甲苯胺藍染色可見細胞外及基質紫紅色易染顆粒減少；經Ⅱ型膠原染色后提示Ⅱ型膠原表達減少。模型制備成功后，將剩下的9孔采用抽簽法取6孔，再采用數字隨機法將其分為空白血清組和含藥血清組，每組各3孔。

2.4 退變軟骨細胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平檢測 空白血清組采用含10%大鼠空白血清的DMEM培養液培養，含藥血清組采用10%大鼠含藥血清的DMEM培養液培養。2組分別于培養24、36、48、72 h時，采用Western Blot法檢測其中的Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平。具體步驟：RIPA裂解液裂解2組軟骨細胞并提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉移至PVGF膜，5%脫脂奶粉封閉；分別加一抗、二抗孵育，經ECL發光，在凝膠成像儀下顯影、拍照，并使用凝膠圖像分析計算2個蛋白與內參二者的光密度比值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，采用秩和檢驗。

3 結 果

2組退變軟骨細胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平比較 見圖1、表1。

圖1 2組退變軟骨細胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白電泳圖

表1 2組退變軟骨細胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平比較（±s）

表1 2組退變軟骨細胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平比較（±s）

注：與24 h比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與36 h比較，3）P＜0.05；與空白血清組同一時間點比較，4）P＜0.05，5）P＜0.01。

時間24 h 36 h 48 h 72 h 24 h 36 h 48 h 72 h組別空白血清組含藥血清組n 3 3 Dkk-1 1.150±0.193 1.052±0.135 0.811±0.0981）0.793±0.1831）1.290±0.277 1.383±0.1131）4）1.652±0.3082）3）5）1.707±0.0932）3）5）sFRP-3 2.424±0.382 2.379±0.301 2.156±0.4961）2.101±0.4951）2.433±0.213 2.613±0.2631）4）2.871±0.1112）3）5）2.926±0.4662）3）5）

4 討 論

Wnt/β-catenin通路系統的激活在KOA關節軟骨退變過程扮演著重要角色，在關節軟骨形態與功能的維持方面起著非常重要的作用，一直是關節軟骨病變研究的熱點［6］。該通路的激活會通過多途徑促進軟骨細胞的破壞，加速軟骨的退變，進而影響關節的結構與功能。

壯骨健膝方是課題組在梳理大量文獻及多年臨床實踐的基礎上，針對改善KOA臨床表現而創立的效驗方，該方由骨碎補、杜仲、桑寄生、獨活等組成，可補肝腎，強筋骨，通絡止痛，臨床療效顯著［7-8］。前期通過動物實驗研究證實：該方可通過促進軟骨細胞增殖及合成膠原、抑制軟骨的降解等起到保護關節軟骨的作用［3］。此外，該方還可抑制Wnt/βcatenin信號通路的激活并減少下游產物對軟骨細胞及基質的損害［9］，但對該信號通路激活過程的具體抑制環節還不明確。DKK-1是一種分泌型蛋白，通過與其相應的受體結合來抑制Wnt/β-catenin信號在細胞內的傳遞，從而抑制Wnt/β-catenin信號激活［10-11］。sFRPs是Wnt信號通路分泌型拮抗劑的最大家族，研究表明sFRP-3可通過半胱氨酸區域（CRD）與主要的Wnt蛋白受體結合形成無功能復合體，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路傳導，在骨代 謝 方 面 作 用 明 顯［12］。因 此，我 們 選 擇DKK-1、sFRP-3做為觀察指標，旨在探討壯骨健膝方在Wnt/β-catenin信號通路跨膜信號傳遞階段對該通路激活的影響。

本研究結果顯示：空白血清組DKK-1、sFRP-3蛋白表達水平隨著時間而逐漸下降，48 h和78 h均顯著低于24 h（P均＜0.05），證實了經IL-1β誘導后的大鼠膝關節軟骨細胞退變伴有Wnt/β-catenin通路激活，這與我們前期研究結果一致。經壯骨健膝方含藥血清干預后，在一個細胞培養期內，含藥血清組DKK-1、sFRP-3蛋白表達水平隨著干預時間的延長而逐漸增強，其中干預36 h高于24 h（P＜0.05），干預48 h和72 h顯著高于24 h（P均＜0.01），干預48 h和72 h高于36 h（P均＜0.05）；與空白血清組同一時間點比較，含藥血清組DKK-1、sFRP-3蛋白表達水平在干預36 h、48 h和72 h時均顯著增高（P＜0.05或0.01）。提示壯骨健膝方含藥血清能夠增加Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平，抑制Wnt/βcatenin信號通路被激活。

本研究從Dkk-1、sFRP-3在Wnt/β-catenin信號通路的作用環節分析而知，壯骨健膝方含藥血清可能對Wnt/β-catenin信號通路的激活有抑制作用，揭示了壯骨健膝方保護膝關節退變軟骨細胞的可能分子機制，為該方的臨床應用提供了進一步的實驗依據。然而，與其他復方相似，壯骨健膝方具有多成分、多靶點特點，本研究僅從增加Wnt/βcatenin信號通路抑制因子Dkk-1、sFRP-3蛋白表達水平探討該方保護膝關節退變軟骨細胞的分子機制，具有一定的局限性。