糖尿病視網(wǎng)膜病實驗動物模型的研究進展

羅 云，葛文秀，孫桂波，孫曉波

(1.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京 100193；2. 哈爾濱商業(yè)大學藥物工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076)

國際糖尿病聯(lián)盟最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2019年全球約4.63億20-79歲成人患糖尿病，預計到2045年，糖尿病患者會達到7.002億；中國2019年患者數(shù)量為1.164億，給國家醫(yī)療保障體系及家庭經(jīng)濟負擔帶來巨大的壓力。流行病學數(shù)據(jù)表明，約有1/3的糖尿病患者晚期會出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)，是成年人致盲的原因之一[1]。近年研究表明，持續(xù)高血糖首先誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)病變，導致視網(wǎng)膜微血管疾病，如微血管瘤、出血、基底膜增厚[2]。進一步致使血視網(wǎng)膜屏障通透性增加，導致毛細血管堵塞，引起視網(wǎng)膜缺血，引發(fā)血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達，促進血管新生，最終導致失明。雖然DR的病理形成過程得到了闡述，但是各個環(huán)節(jié)確切的病理機制仍不明確。實驗動物模型是疾病致病機理以及治療藥物的研究方式之一。本文根據(jù)致病誘因綜述近幾年來所報道的實驗動物模型，以期為糖尿病視網(wǎng)膜病研究提供參考。

1 實驗動物的選擇

目前研究報道最多的是嚙齒動物如小鼠、大鼠，小鼠具有與人類遺傳、生理特性相似性，易于控制，繁殖迅速，常用于DR的研究；大鼠同樣具備價格低廉，容易飼養(yǎng)等優(yōu)點，也常用于糖尿病并發(fā)癥的研究。靈長目動物恒河猴等也用于建立DR動物模型。狗的DR形態(tài)被認為是與人類最相似，豬與斑馬魚因其與人類有相似的血管和視網(wǎng)膜結構，也被用作DR實驗研究。斑馬魚是糖尿病研究中一個新興的疾病模式動物，它的葡萄糖代謝形成的途徑與人類非常相似。同時，斑馬魚還可提供復雜的成像技術，并允許簡單和快速的遺傳和藥理方法與高通量等優(yōu)點，因此也大量應用于糖尿病并發(fā)癥動物模型。

2 糖尿病視網(wǎng)膜病實驗動物模型

2.1 誘發(fā)型動物模型

2.1.1鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 利用STZ建立DR模型較為普遍，最近一篇報道利用該模型證實了C反應蛋白促進視網(wǎng)膜神經(jīng)退化和視網(wǎng)膜白斑淤積和無細胞毛細血管形成，進而加速DR的形成[3]。梅茜鈺等[4]通過連續(xù)5 d腹腔注射STZ建立小鼠糖尿病視網(wǎng)膜病模型，并對夏枯草水提物進行了保護作用研究。該模型建立簡單易操作，應用量最大，但是模型不太穩(wěn)定，見Tab 1。

2.1.2四氧嘧啶 連續(xù)一周給予白化病小鼠皮下注射四氧嘧啶水合物成功建立1型DR模型，并發(fā)現(xiàn)卡馬西平能夠顯著改善DR中視網(wǎng)膜損傷和神經(jīng)病變[5]。一次性給予C57BL/6小鼠四氧嘧啶成功實現(xiàn)小鼠新生血管顯著增加，二甲雙胍能夠通過抑制VEGF-A減少新生血管[6]。連續(xù)3 d給予Wistar大鼠腹腔注射四氧嘧啶水合物，成功建立2型DR模型，并研究了二氫槲皮素治療DR的藥理作用[7]。連續(xù)3次給予大鼠腹腔注射四氧嘧啶成功建立早期視網(wǎng)膜病變，并探討了視網(wǎng)膜和脈絡膜細胞結構病理性改變[8]。該模型的主要特征見Tab 2。

2.1.3甲基乙二醛 甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)是葡萄糖代謝的中間產(chǎn)物，是糖尿病患者血液或組織中糖基化終產(chǎn)物的前體。Schlotterer等[9]給予雄性Wistar大鼠MG后，成功促使視網(wǎng)膜周細胞丟失，增加無毛細血管數(shù)量，減少雙極細胞功能等DR特征。研究者利用MG溶液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，成功誘導斑馬魚視網(wǎng)膜血管新生，加入VEGFR抑制劑抑制MG的促血管新生作用，證明該模型可用于DR血管新生研究[10]。目前，該模型應用相對較少。其主要特征見Tab 3。

Tab 1 Major features of STZ-induced DR in experimental animal models

Tab 2 Major features of alloxan-induced DR in experimental animal models

Tab 4 Major features of hyperoxia-induced DR in experimental animal models

2.1.4高氧環(huán)境 由于成年嚙齒糖尿病動物模型中不利于觀察視網(wǎng)膜血管新生，常利用高氧環(huán)境建立該病理模型。7日齡小鼠置于密閉的高氧環(huán)境連續(xù)5 d后，通過檢測視網(wǎng)膜血管新生、炎癥因子等成功構建DR模型[11]。利用該模型，研究報道了Sema4D/PlexinB1信號通路參與了DR的形成[12]。該模型多用于探討DR中血管新生機理及其治療研究,其主要特征見Tab 4。

2.1.5高糖、高脂飲食 利用高脂、高糖飲食，Rithwick等[13]首先報道發(fā)現(xiàn)在高脂誘導的DR中視網(wǎng)膜功能性缺陷先于結構性病變。建立小鼠早期DR模型，證明精氨酸酶2及tau蛋白磷酸化在糖尿病視網(wǎng)膜病形成中的重要作用[14-15]。研究還報道了二甲雙胍雖然能夠降低高脂誘導的小鼠體質量增加和血糖水平，但是不能改變視網(wǎng)膜光反應及阻止視網(wǎng)膜血管新生[16]。Hammoum等[17]利用高脂成功誘導沙鼠2型糖尿病視網(wǎng)膜病實驗動物模型。陳鏡妃等[18]利用高脂飲食成功建立獼猴早期糖尿病視網(wǎng)膜病變，并證實獼猴視網(wǎng)膜VEGF和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF)的mRNA表達水平分別上調和下調。利用高糖培養(yǎng)斑馬魚胚胎6 d后，VEGFR和NO表達水平顯著增加，成功建立短期DR實驗動物模型[19]。Lim等[20]西方飲食飼養(yǎng)Ossabaw豬，建立早期DR小型豬模型。該模型應用較多，且更貼合臨床,其主要特征見Tab 5。

2.2 基因型動物模型

2.2.1db/db小鼠 在2014年就有研究表明，db/db小鼠可復制人類糖尿病視網(wǎng)膜的神經(jīng)退行性過程的特征，因此該小鼠可作為一個合適的實驗動物模型來研究糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)病變的致病機理及發(fā)現(xiàn)治療藥物。利用該模型，羅云等[21]發(fā)現(xiàn)中藥復方渴絡欣具有減緩視網(wǎng)膜神經(jīng)退變的作用。此模型目前最大的不足之處是未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管滲漏及血管新生等現(xiàn)象，很難使得其與臨床DR的分級相對應。

2.2.2Zucker肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty，ZDF) ZDF大鼠是一種肥胖型大鼠，大約30年前首次報道ZDF大鼠較對照組大鼠視網(wǎng)膜細胞增多，同時視網(wǎng)膜毛細血管基底膜厚度增加，提示其可作為糖尿病視網(wǎng)膜病藥物干預研究模型。近年來進一步證實隨著年齡的增加，ZDF大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)出現(xiàn)退行性改變，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)厚度增加，但是細胞核的數(shù)量減少；神經(jīng)膠質細胞激活，GFAP表達水平增加等特征[22]。另外，Szabó等[23]發(fā)現(xiàn)32周齡ZDF大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)膠質細胞數(shù)量增加，通過視錐蛋白表達模式的改變表明感光層外節(jié)段降解，這些特征與1型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變特征類似。利用ZDF大鼠模型，研究者發(fā)現(xiàn)了外周血線粒體DNA損傷是DR形成的一個潛在的生物標志物[24]。該模型可能由于其價格昂貴等因素，還未被普遍使用。

2.2.3斑馬魚 最近一項研究表明，斑馬魚胰腺轉錄因子pdx1突變體在2月齡時，具有明顯的糖尿病視網(wǎng)膜病血管表型；在12月齡時視網(wǎng)膜出現(xiàn)動脈性血管減少、毛細血管彎曲、神經(jīng)病變以及光感受器受損等病理特征；表明該突變體可作為嚙齒動物和其他哺乳動物DR模型的補充，特別是對糖尿病微血管和視網(wǎng)膜神經(jīng)疾病相互作用的機制研究[25]。斑馬魚因其自身在影像學上的優(yōu)勢，未來其在DR模型中的研究將占有重要的位置。

Tab 5 Major features of high-glucose-high-fat diet-induced DR in experimental animal models

3 存在問題及展望

糖尿病視網(wǎng)膜病，因目前仍無徹底根治的方法給糖尿病患者及其家庭帶來了巨大的經(jīng)濟負擔和精神壓力。盡管雷珠單抗和康柏西普類藥物在臨床治療糖尿病黃斑變性已經(jīng)有很好的療效，但是DR患者數(shù)量仍然未得到顯著改善，未滿足臨床需求[26-27]。糖尿病視網(wǎng)膜病實驗動物模型在DR的發(fā)展及藥物治療研究中扮演至關重要的作用。DR是一種復雜的多因素影響的疾病，其實驗動物模型的建立相對困難。總體來看，近些年主要以STZ誘導較多，同時基因型小鼠因其血糖相對穩(wěn)定也運用較多；ZDF大鼠能看出血管滲漏，但因其價格昂貴目前應用還相對較少；斑馬魚雖然有其優(yōu)勢，但是由于與哺乳動物相差較大只能作更為基礎的研究或前期藥物篩選。另外，由于模式動物如斑馬魚，以及基因敲除實驗動物模型的興起，胰島切除、堿燒傷等傳統(tǒng)操作難、死亡率高等缺點的實驗動物模型近幾年已經(jīng)不再使用；恒河猴因其特殊飼養(yǎng)條件及成本高等，該模型也逐漸淘汰。

目前的實驗動物模只具有DR臨床某種或某幾種特征，如果要評價血管新生只能用新生鼠高氧誘導模型，這些不足導致無法與臨床糖網(wǎng)指南里的分級相對應。因此未來DR實驗動物模型應該結合其中幾種特征，以建立與臨床更接近的疾病特征。例如，通過STZ與轉基因結合，或許可以建立既有神經(jīng)病變等特征還能看見視網(wǎng)膜血管新生。更為重要的是，DR實驗動物模型主要集中于糖尿病早期階段的特征，而不具有晚期糖網(wǎng)的臨床特征；目前常用的模式動物(大鼠、小鼠、斑馬魚)眼睛沒有黃斑區(qū)，這些都限制了DR形成機制及藥物治療研究。

總之，雖然近些年通過不同方法構建了DR實驗動物模型，但還是存在穩(wěn)定性不高、特點單一等問題。因此，必須秉承動物模型研究真實性、穩(wěn)定性、可行性、經(jīng)濟性等原則，繼續(xù)優(yōu)化模型的構建方法，利用視網(wǎng)膜相干斷層掃描、視網(wǎng)膜造影等科研設備，利用表型與機制相結合的方式，加大模型的研發(fā)力度，構建出更加貼近臨床實際的國際公認的糖尿病視網(wǎng)膜病模型。