非編碼RNA對肺源性心臟病的表觀遺傳調控

李冠烈，申 翱，余細勇

(廣州醫科大學藥學院，廣東省分子靶標與臨床藥理學重點實驗室，呼吸疾病國家重點實驗室藥理學組，廣州 511436)

心血管病是全球死亡率最高的疾病，具有致死、致殘率高且生活質量降低的特點，常見類型包括原發性高血壓、風濕性心臟病、動脈粥樣硬化和肺源性心臟病(肺心病)等[1]。其中肺源性心臟病(pulmonary heart disease/cor pulmonale，PHD)通常指因肺組織或肺動脈及其分支發生病變(如肺部疾病、肺血管病變、胸廓畸形、呼吸中樞障礙等)引起肺循環阻力增加，引發肺高壓(pulmonary hypertension，PH)，從而使右心發生組織重塑(包括心肌肥厚、心肌纖維化等)，最終發展為右心衰竭的一種心血管病[2]。

我國肺心病患者至少有500萬，其中14歲以上人群慢性肺心病的患病率為4.8‰，并隨年齡增長而患病率增高[3]。肺心病晚期引起嚴重并發癥，導致人體多器官功能衰竭，病死率高達55%，嚴重危害人們的健康。目前該病采用對癥治療，使用機械通氣、抗生素、利尿劑、強心劑和血管擴張劑等來維持肺功能和氧飽和度，現有治療手段均以延緩基礎疾病進展為目的，對心肺已形成的組織損傷無法修復[4]。因此，亟待尋找能夠逆轉心肺重構進程、有效治療肺心病的新靶點、新技術、新藥物，從而改善患者的生存狀況，并減輕其醫療負擔。

表觀遺傳是指在DNA序列未發生改變的情況下，基因表達發生了可遺傳的變化。表觀遺傳調控主要涉及DNA甲基化、組蛋白多種翻譯后修飾以及非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)調控等[5]。表觀遺傳深度參與了個體的發育分化和眾多疾病的病理進程，其中ncRNA已被發現在心血管病的發生和發展中有重要作用，有望成為肺心病治療的重要新靶點。國內外缺乏對于ncRNA在肺心病中作用機制的歸納總結，本文整理了與肺心病疾病表型相關的ncRNA研究，以ncRNA為例探討了肺心病表觀遺傳調控的研究現狀。

1 非編碼RNA

ncRNA是不編碼蛋白的轉錄物，能夠控制DNA甲基化、影響組蛋白修飾、調控 mRNA 的轉錄、穩定性和翻譯，當ncRNA 失調時可破壞功能性蛋白表達的生理平衡，影響疾病的發展。根據轉錄本的長度，ncRNA大致分為短ncRNA和長ncRNA，本文將主要介紹研究中常見的3種：短ncRNA主要包含在不同物種間高度保守的microRNA(miRNA/miR)；而長ncRNA(lncRNA)則是大于200個核苷酸的ncRNA；另外還有一種結構特殊的環狀RNA(cirRNA)，雖然近年才被發現，但由于其物種間保守性和穩定性而備受關注。

miRNA通常在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄成pre-miRNA，隨后經核酸酶Dicer剪切產生成熟的miRNA，與mRNA堿基序列互補、抑制mRNA的翻譯，從而調節由它們介導的細胞功能。lncRNA相對于miRNA在機體生理過程中的功能更為豐富，可以和DNA、RNA、蛋白質等多種生物大分子相互作用，作為信號、誘餌、向導或支架來控制基因的表達。同時，lncRNA在體內具有很高的組織特異性，而在物種之間的保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類之外的其它生物中找到。cirRNA的作用機制是通過海綿化miRNA或直接與RNA結合蛋白相互作用從而調控機體生理進程，由于反向剪接形成的封閉環狀RNA結構不受RNA外切酶影響，相對線性RNA更穩定。

ncRNA調控在不改變DNA序列的情況下影響生理進程，一方面能直接調控下游蛋白表達，另一方面能影響DNA甲基化或組蛋白修飾從而實現向上調節。例如lncRNA TUG1與miRNA海綿化反應上調了組蛋白去乙酰化酶HDAC3，后者刺激細胞內ROS的產生從而加重缺血性心肌病的病理進程[6]。近年來通過調控ncRNA的表達從而影響疾病的發生和發展已經成為研究的熱門，篩選肺心病中差異性表達的ncRNA并用siRNA或抑制劑等手段調控ncRNA或許是治療肺心病的新思路與靶點，見Fig 1。

Fig 1 Potential mechanisms of non-codingRNA in cardiopulmonary remodeling

2 肺心病中的非編碼RNA研究

由于ncRNA在發育分化和疾病進程中的重要調控作用，在心血管領域和腫瘤領域已有大量ncRNA的研究。然而目前ncRNA 在肺心病中的研究仍較少，已有報道中多數是心臟或肺組織中ncRNA 的作用機制研究(如ncRNA 在心臟發育分化、心臟病發生和發展，或者是肺動脈高壓中血管重塑、炎癥浸潤中的作用等)，專注于探索肺心病中ncRNA在心、肺重塑過程的機制研究尚未見報道。

肺心病的表型特征主要體現在心臟和肺組織的病變重塑兩個方面，并具有時序性。心臟方面有缺氧、高壓導致的心肌肥大、纖維化等，長期負荷將轉為心力衰竭[7]；肺組織由于不同的原發疾病如慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)和肺栓塞(pulmonary embolism，PE)等所造成的病變不同，主要導致肺部炎癥浸潤、肺血管內膜增生、血管收縮導致的動脈壓力增高等[8]。本文根據肺心病的病理生理特征，整理了ncRNA在肺心病中的相關研究文獻(Tab 1)，并針對部分ncRNA在下文中重點闡述。

2.1 肺血管重塑/細胞增殖遷移凋亡肺血管重塑主要包括肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)和肺動脈內皮細胞(pulmonary artery endothelial cells，PAECs)的增殖、遷移和分化等。PAH的典型特征之一是動脈肌化和肥大導致的血管叢樣病變。外部條件的刺激(如缺氧、藥物毒素暴露和DNA損傷等)會導致血管各類細胞(內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞)應激而產生血管壁增厚、血管內徑變窄以及灌注阻力增加等表型改變。盡管尚不能確定哪種細胞主導了疾病表型的改變，但血管細胞之間存在串擾；當組織分化成熟時，平滑肌細胞不再增殖或遷移，而是通過募集內皮細胞前體來促進血管穩定，后者通常分化為平滑肌樣細胞[9]。

已有多項研究表明ncRNA在血管重塑中有重要作用。其中在PAH患者肺組織和低氧條件下的PASMC 中發現lncRNA Ang362，miR-221和miR-222的表達顯著增加，lncRNA Ang362的過表達促進了PASMC的增殖和遷移，而抑制lncRNA Ang362具有相反的作用；實驗證明lncRNA Ang362上調了PASMC中miR-221和miR-222的表達并激活了NFκB信號通路，通過使用miR-221和miR-222抑制劑均減弱了lncRNA Ang362導致的增殖和遷移作用，并增加了細胞的凋亡[10]。

Tab 1 ncRNA in PHD phenotypes

另一研究發現，PAH 患者中lncRNA SMILR和Rho蛋白表達上調，而miR-141 表達下調，實驗證明SMILR直接與miR-141 相互作用并對其表達負調控，減少SMILR的表達能夠抑制缺氧誘導的PASMC增殖和遷移。此外，miR-141的過表達可通過與RhoA 結合而抑制 RhoA/ROCK 途徑，從而抑制與細胞增殖相關的信號通路。該研究通過抑制SMILR可以顯著抑制野百合堿(MCT)誘導的PAH大鼠的RhoA/ROCK 活化和血管重塑，表明抑制SMILR可有效提高miR-141的表達，進而抑制 RhoA/ROCK通路以調節PAH的血管重構并降低血壓[11]。

肺部疾病中ncRNA調控血管重塑的研究還有很多，多與肺血管平滑肌細胞或內皮細胞的增殖、遷移和凋亡有關。值得注意的是，這些ncRNA調控不同信號通路卻表現出類似的表型變化，說明肺心病的發病機制非常復雜。

2.2 血管炎癥和血管收縮血管周圍炎癥和血管收縮是肺心病常見病理狀態，由于血管收縮的缺氧缺血環境以及免疫反應導致的級聯反應將加重肺部病變，進而產生繼發性右心功能障礙[12]。ncRNA在炎癥發生中通常有調控作用，例如lncRNA H19被發現與炎癥有關，在MCT誘導的PAH大鼠/小鼠血清和肺中高表達，同時AT1R被H19通過PDGF-BB刺激后的miR let-7b上調表達。H19和AT1R的過表達可以促進PASMC的體外增殖，而敲除H19基因可保護小鼠免受MCT注射后造成的肺動脈重塑和PAH侵害[13]。

另一研究發現，在患有嚴重PH的人或牛的肺動脈中分離出的成纖維細胞中，miR-124表達下降、調控糖代謝的PKM蛋白兩種變體PKM2/PKM1比值上升。由于PKM2會引發細胞增殖和炎癥因子IL-1β的表達，過表達miR-124經由剪接因子PTBP1可達到修復PKM2/PKM1比值的目的，從而阻止糖代謝紊亂、減少細胞增殖和炎癥反應[14]。

肺部病變的表型特征除血管過度增殖外還包括血管收縮。由內皮細胞分泌的旁分泌生長因子(如血管內皮生長因子)或血管活性介質(如內皮素-1和5-羥色胺)的釋放失調將使血管收縮，血管壓力上升結合血管增殖從而形成肺動脈高壓。miR-130/301家族是PH中多種促增殖信號通路的調節劑，同時其還通過調節血管舒縮效應子參與不同細胞類型間的通訊。例如miR-130/301-PPARγ軸可調節血管活性因子內皮素-1，可作為PAEC和PASMC之間血管溝通和血管舒縮張力的調控介質[15]。

2.3 TGF-β/Smad信號通路有許多潛在因素可以促成PH的發生和發展，骨形態發生蛋白受體2(BMP-RII)被發現與疾病直接相關，超過70%家族性PAH患者和20%特發性PAH患者出現BMP-RII突變[16]。缺氧環境下導致的肺動脈血管重塑通常可在恢復正常供氧后逆轉，但BMP-RII基因的表達缺失會導致內皮細胞的線粒體功能障礙，并阻礙復氧后的血管重塑逆轉過程[17]。

BMP屬于轉化生長因子β(TGFβ)家族，控制細胞的增殖、分化和凋亡，并在胚胎發育和維持組織穩態中發揮重要作用。近年來有研究發現ncRNA能通過調控BMP信號通路來改善PH中的血管重塑表型。Rothman等在PH患者或PH動物模型中檢測到miR-140-5p水平的降低，抑制miR-140-5p表達能夠促進PASMC的體外增殖和遷移，而過表達miR-140-5p則能夠阻止PAH大鼠模型中的疾病進程。進一步發現miR-140-5p的靶點E3泛素連接酶SMURF1是BMP信號傳導的調節物，敲低SMURF1能夠改變BMP信號傳導。通過增強miR-140-5p或抑制SMURF1的表達能夠調控BMP信號傳導進而減輕PH中的血管重塑[18]。

外源性BMP-RII遞送至內皮細胞是恢復BMP-RII表達和功能的方法，但考慮到由病毒載體遞送帶來的限制(安全性、特異性、蛋白表達量等)，該技術還難以應用于臨床。而ncRNA對BMP-RII信號的調節是一種潛在的替代治療方法，可以預防和逆轉肺血管重構，也許能夠開發成有效治療肺心病的手段。

2.4 繼發性右心重塑在肺心病中，由肺血管增殖和收縮引發的肺動脈高壓會造成心臟后負荷增大并進入代償階段，當心臟失代償時產生組織重塑和功能障礙，長期病變轉化為心力衰竭。右心室衰竭是PH患者死亡的主要原因，病理狀態下右心室對肺血管阻力的適應能力與肺血管變化有關，是患者維持心臟功能和生存的主要決定因素[19]。在多個生存研究中已經證實了右心室在PH中的重要性，許多與右心室功能直接相關的血液動力學因素已經被確定為肺心病死亡率的重要預測指標，例如平均肺動脈壓、右心室壓、心輸出量和心臟指數等[20]。

從正常的心臟解剖結構上看，來自肺的后負荷較低，右心壁肌較薄且順應性要比左心更高。當由于肺部疾病引起心臟后負荷增加時，右心響應壓力刺激收縮增強并且容積擴大，右心擴張意味著壁肌張力的增加，同時增加了心肌的需氧量和降低了血液灌注[21]。在缺血缺氧和高壓的環境下心肌細胞發生一系列復雜的變化以及細胞外基質增加，涉及到氧化應激、免疫激活和心肌細胞凋亡等病理進程[22]。

這種繼發性的右心重塑損傷主要包括心肌肥大、心肌纖維化、心力衰竭和炎癥浸潤等，而促成因素不僅僅只有后負荷增加，否則針對降低后負荷的治療應取得預期的療效，而并非停留于維持心肺功能的階段[23]。心肺之間可能存在密切的物質交換從而導致繼發性心臟病的發生，ncRNA作為調控生理進程的調節劑在兩者之間扮演著重要角色。例如從右心衰竭患者的組織中發現miR-126表達下調， 且SPRED-1蛋白是miR-126的下游分子。SPRED-1增加會導致RAF和MAPK激活的減少，從而降低了右心微血管的密度，并引發心臟重塑病變；而miR-126過表達能夠促進內皮細胞的血管生成并且在MCT誘導的PAH大鼠中改善心臟血管密度和心臟功能[24]。

PH患者內皮細胞分泌的ncRNA被發現能夠引發繼發性心臟重塑。miR-424(322)在PH患者中表達上調，實驗證明miR-424(322)通過靶向SMURF1來維持BMP-RI信號傳導；缺氧會誘導PAECs分泌miR-424(322)，而心肌細胞吸收miR-424(322)后會導致SMURF1的下調，表明ncRNA的調控與心肺重塑密切相關[25]。另一項研究表明，miR-140在PAH大鼠右心肥厚中被上調，其靶點MFN1(線粒體融合蛋白1)被下調。miR-140的增加和MFN1的減少均與右心室收縮壓(RVSP)和右心肥厚的增加呈線性相關[26]。

研究表明，肺心病中的低氧環境驅動了心臟特異性ncRNA的表達，通過誘導小鼠肺泡缺氧引發心肌缺氧，然后進行心臟組織ncRNA差異性表達的測序，篩選出顯著性下調的ncRNA。miR-146b-5p在低氧環境下被抑制，TRAF6作為下游靶標物同樣降低表達，同時誘導促炎性IL-6和CCL2(MCP-1)，提示缺氧誘導的miR-146b-TRAF6-IL-6/CCL2(MCP-1)軸可能驅動心臟纖維化和功能障礙[27]。

事實上，雖然少部分研究已表明，ncRNA在PH中的血管重塑或右心重塑中有重要作用，通過調控ncRNA的表達能夠影響PH的疾病進程，但沒有解釋心肺串擾，以及后負荷增加如何引發繼發性心臟病的產生。有研究顯示在PH中由肺部產生的ncRNA經外泌體傳遞到心臟被吸收，進而產生了繼發性心臟重塑，提示外泌體在心肺串擾中起重要作用[28]，但深入的機制還有待進一步研究。

3 結語

除了ncRNA，研究表明其他類型的表觀遺傳調控也參與了肺心病的發生和發展。例如Boucherat等[29]在PAH患者和大鼠模型中發現組蛋白去乙?；窰DAC6顯著上調，HDAC6將Ku70維持在低乙?；癄顟B，阻止了Bax轉運至線粒體并防止細胞凋亡；抑制HDAC6可以減少PASMC增殖以及提高抗凋亡能力，而在體內實驗中能夠改善PAH的疾病進程。此外，HDAC6缺陷的小鼠能夠抵抗慢性低氧引起的PAH，提示HDAC6功能喪失有助于預防PAH。同樣，Archer等[30]證明在PAH患者和大鼠模型中SOD2(超氧化物歧化酶-2)的下調是由于其增強子和啟動子區域中CpG島被選擇性過甲基化導致的，而DNA甲基轉移酶抑制劑5′-氮雜-2′-脫氧胞苷可以逆轉SOD2的下調，這種表觀遺傳變化激活了HIF-1(缺氧誘導因子-1)，并在PASMC中產生了抗細胞增殖、抗凋亡的表型。因此，從表觀遺傳調控的多個角度去研究肺心病，有助于進一步揭示心肺重塑的病理機制，從而為逆轉疾病進程和提高治療效果奠定基礎。

ncRNA的發現使人們對疾病的理解進入了更深的層次，大量研究表明在心、肺重塑中ncRNA均起到了重要作用，并且出現了基于調控ncRNA表達的化合物或藥物，為肺心病的治療提供了新選擇。國內外對于ncRNA分別在肺動脈高壓和心臟疾病中的調控作用機制已有大量研究和總結，但從心肺系統整體發病機制角度探討ncRNA在肺心病中的作用尚未有報道，本文主要歸納了在肺部疾病所引發右心或全心重塑的相關ncRNA研究。事實上，現階段大多數相關研究只涉及細胞方面的實驗，未能結合動物實驗驗證調控ncRNA的治療效果，無法揭示肺部病變如何引發繼發性心臟重塑的生理進程。此外，ncRNA在肺心病的研究中比較常見的是miRNA和lncRNA，而cirRNA在肺心病中的作用機制研究較少；cirRNA具有保守性高、穩定性好的特點，在肺心病的研究中潛力巨大，值得研究者注意。

肺心病的臨床治療還處于延緩病理狀況、無法有效逆轉疾病進程的階段，ncRNA不僅在作為治療靶點開發新的治療措施中展示出極大的潛力，同時能夠作為疾病標志物，從而提高預后水平，通過調控ncRNA揭示心肺重塑中的表觀遺傳調控并干預疾病的發生發展將成為治療肺心病的新思路。