自噬水平與白血病K562/ADM細胞耐藥的關系研究

李彩麗，高 靜，黃雙盛，趙永勛，劉 進，黃 濤，李 敏

(1.西北民族大學醫學部生物化學教研室, 2. 西北民族大學附屬醫院檢驗科，甘肅 蘭州 730030；3. 蘭州大學第一附屬醫院腫瘤外科，甘肅 蘭州 730000)

白血病是造血系統的惡性腫瘤，主要臨床表現為出血、感染、貧血和多器官浸潤等，病情進展迅速，病死率高。其發病原因和發病機制目前尚不完全清楚[1]。白血病的治療方針是通過合理的綜合性治療，使白血病患者的預后得到極大改善，獲得治愈或長期穩定生存[2]。化療依然是治療白血病的主要方法，但化療過程中藥物誘導產生的耐藥現象是臨床化療失敗的主要原因之一。白血病耐藥發生率約占白血病治療人數的33%[3]，根據其發生原因不同分為兩類：一類是細胞天然對某種化療藥物產生耐受，稱為原發性耐藥(primary drug resistance);另一類是化療藥物長期作用后細胞對該種藥物產生抵抗或耐受現象，稱為繼發性耐藥(secondary resistance),有些白血病細胞甚至會產生繼發性多藥耐藥現象(multidrug resistance，MDR)[4]。MDR的發生機制非常復雜，近年來研究發現，鉑類藥物和烷化劑等耐藥與細胞自噬水平有關[5]。本研究以慢性髓系白血病K562細胞為研究對象，用蒽環類化療藥物阿霉素(adriamycin，ADM)體外“逐步提高藥物濃度+間歇性刺激”的方式逐步誘導建立對ADM有穩定耐藥性的K562/ADM細胞，一方面觀察K562/ADM細胞對吡柔比星、柔紅霉素等其它化療藥物是否有交叉耐藥現象，從而篩選出與常規化療藥物不存在交叉耐藥的新型藥物，為臨床攻克白血病MDR提供研究基礎。另一方面我們通過觀察耐藥前后細胞自噬水平的變化，并用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制細胞自噬，觀察自噬水平對K562/ADM細胞化療敏感性及耐藥相關蛋白表達的影響，旨在研究K562/ADM細胞產生耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

1.1.1細胞株 人類白血病K562細胞購自American Type Culture Collection (ATCC，Manassas，USA)。

1.1.2K562/ADM細胞的誘導與建立 以K562細胞為靶細胞，從ADM濃度0.02 μmol·L-1開始，采用“逐步提高藥物濃度+間歇性刺激”的方式逐步誘導其對ADM產生耐藥，最終誘導產生能夠穩定耐受15 μmol·L-1ADM的耐藥細胞，稱之為K562/ADM細胞，該細胞在液氮中凍存3個月以上復蘇后其耐藥性依然維持穩定。

1.1.3試劑 MTT(M2003)，三氧化二砷(arsenictrioxide，As2O3)購自美國Sigma公司，As2O3用0.1 mol·L-1NaOH溶解后，用PBS配制成10 mmol·L-1的貯存液；ADM(國藥準字：H44024359)購自深圳萬樂藥業有限公司；柔紅霉素(國藥準字：H20058349)、吡柔比星(國藥準字：H20045982)購自浙江海正藥業有限公司；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)(國藥準字：H31020593)購自上海旭東海普藥業有限公司；長春新堿(國藥準字：H20064346)購自廣東嶺南制藥有限公司；單丹黃酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)(貨號：30432)購自美國Sigma公司；蛋白提取及定量試劑盒(索萊寶公司)；兔源LC3-Ⅰ/Ⅱ(貨號：#4108)、Beclin-1(貨號：#3495)、p62(貨號：#5114)、P-gp(貨號：#13978)、MRP1(貨號：#72202)、BCRP(貨號：#4477)一抗和鼠源β-actin一抗(貨號：#3700)均購自美國CST公司；IRDye800DX標記的羊抗鼠(C80816-10)和IRDye700DX標記的羊抗兔(C81106-06)紅外熒光抗體均購自LI-COR公司。

1.1.4儀器 CO2細胞培養箱(日本三洋公司)；紅外熒光掃描成像系統(美國LI-COR公司)；酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Tek公司)；透射電鏡(日本電子公司)；轉印電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；流式細胞儀(美國BECKMAN COULTER)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與處理 K562細胞及K562/ADM細胞以5×104個·L-1接種到含10%胎牛血清及2 mmol·L-1谷氨酰胺的RPMI 1640 培養液中，置于5% CO2、37 ℃ 及飽和濕度培養箱中進行常規培養。

1.2.2MTT法檢測細胞對化療藥物的敏感性 將處于對數生長期的K562細胞和K562/ADM細胞分別按5×107·L-1接種96孔板，按照一定梯度分別加入不同濃度的阿霉素、柔和霉素、As2O3、吡柔比星、5-FU、長春新堿等，5 % CO2、37 ℃培養箱中分別培養24、48和72 h,于培養終止前4 h 每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，繼續培養4 h，每孔加入10%SDS后放培養箱過夜，用酶聯免疫檢測儀570 nm波長檢測吸光值(A值)，依據細胞生長抑制率公式計算藥物對細胞的增殖抑制率和半數抑制濃度(IC50)，每個濃度設4個復孔。抑制率計算公式為：細胞生長抑制率/%=(對照組A值 -實驗組A值)/對照組A值 ×100%。

1.2.3透射電鏡觀察細胞的自噬形態學改變 收集細胞，PBS洗滌，3%戊二醛固定，丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋，切片，枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙重染色，透射電鏡觀察細胞的超微結構。

1.2.4MDC染色熒光顯微鏡觀察細胞自噬水平 在培養的K562細胞和K562/ADM細胞中分別加入酸性囊泡染液MDC使其終濃度為0.05 mmol·L-1，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌，調整細胞濃度并滴片，用熒光顯微鏡觀察細胞自噬變化。

1.2.5Annexin-V/PI 雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率 離心收集細胞，PBS洗滌，結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin-V和PI染液，避光孵育，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.6Western blot法檢測自噬及耐藥相關蛋白的表達 收集各組細胞，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸5 min后上樣，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉法轉膜、5%脫脂奶粉+PBST封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后按1 ∶10 000比例加入IRDye700DX和IRDye800CW二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，用Odyssey紅外熒光掃描儀掃描并分析。

1.2.7統計學分析 實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行分析處理，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 ADM對K562細胞及K562/ADM細胞的增殖抑制作用不同濃度ADM對親本K562細胞和K562/ADM細胞的增殖抑制程度存在明顯差異(Fig 1A)。ADM對K562細胞24 h、48 h和72 h的IC50分別為5.53、3.87和0.74 μmol·L-1；而ADM對K562/ADM細胞24 h、48 h和72 h的IC50分別為134.4、79.7和53.8μmol·L-1(Fig 1B)，3個時間段的藥物抗性系數均大于20。

2.2 K562/ADM細胞出現多藥耐藥現象用不同濃度5-FU、吡柔比星、柔紅霉素、長春新堿和As2O3分別作用于親本K562細胞和K562/ADM細胞24、48和72h，計算IC50值并比較這兩種細胞對以上幾種化療藥物的敏感性。結果表明K562/ADM細胞對5-FU、吡柔比星、柔紅霉素、長春新堿等4種化療藥物均出現明顯的交叉耐藥現象，但對As2O3并不出現耐藥現象。相反，K562/ADM細胞對As2O3更加敏感，24 h、48 h和72 h的IC50值較K562細胞分別下降31.6%、36.3%和42.7%(Fig 2)。這也進一步說明As2O3與其他化療藥物的作用靶點不同，可用于治療對其他化療藥物耐受或化療后復發的白血病患者。

2.3 K562/ADM細胞耐藥前后細胞自噬水平的變化用透射電鏡和MDC染色熒光顯微鏡觀察發現，K562/ADM細胞內自噬體數量和MDC點塊狀熒光強度較K562細胞顯著增多。用Western blot檢測K562/ADM細胞耐藥前后自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、p62的表達水平。結果表明，K562/ADM細胞內與自噬體形成有關的蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達水平較親本K562細胞分別增加了0.78倍和6.5倍。而p62作為自噬的底物蛋白，其表達水平隨著細胞自噬水平的增高反而降低(Fig 3)。這說明K562細胞對ADM耐藥后細胞自噬水平較耐藥前明顯增強。

Fig 1 The inhibitory effect of ADM on K562 and

2.4 3-MA對K562/ADM細胞化療敏感性的影響用3 mmol·L-13-MA預處理K562/ADM細胞3 h后再用不同濃度ADM作用細胞72 h，對K562/ADM細胞的增殖抑制程度較ADM單獨作用組顯著增加。3-MA與ADM聯合作用組的IC50為11.3 μmol·L-1，較ADM單獨作用組降低了74.8%(Fig 4A)。用Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡率，3 mmol·L-13-MA與30 μmol·L-1ADM聯合作用組的總凋亡率為41.4%，而ADM單獨作用組的總凋亡率為18.5%，兩者相比差異有顯著性(P<0.01)(Fig 4B，4C)。

2.5 3-MA對K562/ADM細胞內耐藥相關蛋白表達水平的影響P-gp和BCRP均可作為多種親脂性化療藥物(如阿霉素、長春新堿、柔紅霉素、吡柔比星等)的“外排泵”直接將藥物泵出細胞外，避免藥物對細胞造成損傷，從而導致腫瘤耐藥。MRP1能夠識別多種化療藥物與谷胱甘肽(GSH)形成的偶合物并將其轉運出細胞[6-7]，因此，P-gp、MRP1和BCRP 3種蛋白均與腫瘤耐藥有關。我們用Western blot檢測K562/ADM細胞耐藥前后及3 mmol·L-13-MA作用48 h后耐藥相關蛋白P-gp、MRP1和BCRP的表達水平。結果表明，K562/ADM細胞內P-gp、MRP1和BCRP的表達水平較親本K562細胞均顯著上調，而3-MA能有效抑制K562/ADM細胞內P-gp、MRP1和BCRP蛋白的表達(Fig 5)。

Fig 2 K562 /ADM cells resistance to otherchemotherapeutic drugs n=4)

Fig 3 Comparison of autophagy level between K562 and

3 討論

自噬是細胞在外環境刺激下，通過溶酶體降解其內部錯誤折疊的蛋白質、受損的細胞器等內容物而實現自我調節的復雜過程，有眾多基因參與細胞自噬的調節。細胞自噬產生的物質可以供細胞重新利用，可以使細胞在十分嚴峻的生存條件下通過降解自身物質提供營養成分和能量從而得以生存[8]。自噬與腫瘤關系密切，在不利的腫瘤微環境中，自噬降解系統及其嚴密的防御體系構成了腫瘤細胞賴以生存、增殖甚至耐藥和轉移的基礎[6,9-10]。

白血病化療過程中由化療藥物誘發的MDR現象往往是白血病治療失敗和復發的主要原因之一。目前關于MDR現象的確切機制尚不明確，而且至今也缺乏有效的干預措施。有文獻報道證實，自噬參與胃癌、食道癌和肝癌等實體瘤的耐藥性形成[11-13]。基于這些研究背景我們考慮：白血病細胞在某種化療藥物誘導下是否會產生MDR現象？耐藥是否與自噬有關？在本研究中，我們通過模擬臨床化療過程，從0.02 μmol·L-1ADM開始，逐漸提高藥物濃度、間歇性誘導K562細胞對ADM產生耐藥并建立穩定耐受15 μmol·L-1ADM的K562/ADM細胞，并測定該細胞對阿霉素、吡柔比星、柔紅霉素、5-FU、長春新堿和As2O3的敏感性。研究發現K562/ADM細胞對吡柔比星、柔紅霉素、5-FU和長春新堿均產生交叉耐藥現象，而對As2O3較K562細胞更加敏感。這一方面說明K562/ADM細胞出現MDR現象,另一方面說明As2O3在治療白血病方面有獨特優勢，且沒有明顯的骨髓抑制和其他毒副作用。臨床發現在維甲酸治療后達到緩解的急性早幼粒細胞白血病患者中，聯合使用As2O3可以鞏固維甲酸的療效，因此As2O3被認為是維甲酸的黃金搭檔[14-15]。陳竺、陳賽娟等科學家通過臨床試驗使用As2O3對抗全反式維甲酸耐藥取得了成功，這表明As2O3在抗白血病和抗耐藥方面有顯著的效果和獨特的作用機制。因此，開發出與常規化療藥物不存在交叉耐藥并能增強常規藥物療效的新型藥物是攻克白血病MDR的潛在有效機制，也是我們進一步研究的方向。

阿霉素曾被認為是最有效的化療藥物之一，但近年來日趨嚴重的MDR現象嚴重制約了其臨床使用，其引起MDR的機制非常復雜，主要與ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白家族有關，該家族成員P-gp、MRP1和BCRP等耐藥相關蛋白能通過不同機制將化療藥物外排[16]。我們的研究發現，K562/ADM細胞通過高表達P-gp、MRP1和BCRP等蛋白將吡柔比星、柔紅霉素、5-FU和長春新堿等化療藥物泵出細胞，是K562/ADM細胞出現交叉耐藥的重要原因之一。此外，我們通過觀察自噬形態學改變和自噬相關蛋白表達變化客觀反映細胞自噬強度，發現K562/ADM細胞的基礎自噬水平較親本K562細胞顯著增加，抑制自噬既能顯著提高K562/ADM細胞對ADM的敏感性，促進細胞發生凋亡，也能抑制耐藥相關蛋白的表達，這說明細胞自噬水平增高是K562/ADM細胞出現耐藥的另一重要原因。

Fig 4 Effectof 3-MA on sensitivity of K562/ADM cells to n=3)

Fig 5 Expression of resistance-associated n=3)

如今，靶向自噬也逐漸成為靶向治療白細胞等血液腫瘤的重要機制之一，使自噬在血液系統腫瘤中的作用機制得到越來越多的研究和認識。本研究從MDR和自噬角度對K562/ADM細胞進行了初步探究，還需要進一步深入研究。相信隨著科學的發展，自噬與白血病復發、自噬調控及耐藥等問題將會不斷得到揭示。