Fluspirilene下調(diào)Akt抗肝癌的分子機制研究

石西南，張榮平，解宇環(huán)，孟卓然，吳施國，陳 嶸，萬偉萍，張 珊，陳 偉，王 健

(1. 云南中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學教研室， 昆明 650500；2. 黔西南民族職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)藥系， 興義 562400；3. 云南中醫(yī)藥大學中藥學院南藥研究院， 4.云南省高校芳香中藥研究重點實驗室；5. 云南省中醫(yī)治未病理論應(yīng)用研究創(chuàng)新團隊，6. 云南中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院方劑學教研室，7. 云南中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學教研室， 昆明 650500；8.昆明市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，昆明 650032；9. 云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 昆明 650000)

肝癌(hepatic cell carcinoma，HCC)是常見且晚期的慢性肝臟疾病，其死亡率占全世界疾病死亡率的9.1%，在癌癥發(fā)病率排第5位[1]。其疾病形成高風險因子多與乙/丙型肝炎病毒感染[2]、肝毒性化合物、酒精及非酒精性脂肪肝等有關(guān)[3]。

細胞周期紊亂(abnormal cell cycle)是惡性腫瘤形成的一個主要特征。細胞周期蛋白依賴性激酶( cyclin-dependent kinases，CDKs) 的激活與失活維持著細胞周期各時相有序進行[4]。CDK2 與Cyclin E形成細胞周期激酶復合體可磷酸化激活Rb，形成G1過渡到S期的關(guān)鍵步驟[5-6]。抑制CDK2可以抑制腫瘤細胞的增生，為一個很好的腫瘤藥物靶點[7]。

我們前期通過體內(nèi)外分子生物學實驗發(fā)現(xiàn)小分子化合物Fluspirilene通過下調(diào)了CDK2的表達，阻滯了細胞周期G1期，抑制肝癌細胞增殖[8-12]。但是Fluspirilene抗肝癌具體分子通路機制不明。

CDK4/6-cyclin D 和 CDK2-cyclin E兩種細胞周期激酶復合體可解除對含有視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白 (Rb) 和 E2F 的動態(tài)轉(zhuǎn)錄復合體的抑制作用，從而啟動細胞周期G1期到S期的順利轉(zhuǎn)換。在生長因子的作用下，Akt 可以磷酸化 FoxO1/3，并活化FoxO1/3出核功能，實現(xiàn)細胞存活和增殖。大量不同的刺激如TGF-β、DNA 損傷、復制性衰老等可通過轉(zhuǎn)錄因子作用誘導周期依賴性激酶抑制劑 (cyclin-dependent kinas inhibitors，CKIs) 的 Kip/Cip 家族成員p21、p27等水平上調(diào)從而抑制周期依賴性激酶CDK2/4/6的活性達到抑制細胞增殖的作用。前期實驗驗證了Fluspirilene下調(diào)了CDK2水平[12]，抑制肝癌細胞增殖作用，具體分子機制不明。本實驗通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查：Fluspirilene干預了肝癌細胞的基因差異表達，進一步分子功能實驗驗證：Fluspirilene通過調(diào)控Akt激酶活性，下調(diào)磷酸化CDK2蛋白水平，干預細胞周期G1期，達到抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料Fluspirilene(Lot#103M4604V, Sigma)購自于美國Sigma公司。肝癌細胞系 HepG2和Huh7 購自于中國科學典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。胎牛血清購自于Invitrogen, Rockville, Maryland, USA。Akt、GAPDH抗體購自于Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts, USA。細胞用含10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基在溫度37 ℃、5% CO2及 95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13]。

1.2 儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(S111)(Thermo, 美國); Min-PROTEAN Western blot電泳儀器(美國Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)SYSTEM GelDoc XR+IMAGELAB(美國Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查(mRNA array) 將處于對數(shù)生長的HepG2細胞進行消化、計數(shù)，加入六孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，加入2×105個細胞懸液，孵育至細胞長滿到每孔70%-80%，加入Fluspirilene 15 μmol·L-1，4 h后進行細胞收集，加入適量TRIzol裂解液反復吹打混勻至形成清亮的透明液體，轉(zhuǎn)移到無酶管中干冰保存，送檢。實驗重復3次。

1.3.2BALB/C裸鼠移植瘤動物實驗 購買BALB/C裸鼠50只，4-5周,♂,體質(zhì)量(17±2)g(Vital River Laboratory Technology Co. Ltd, Peking, China)動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK(京)2012-0001,遵照昆明醫(yī)科大學動物實驗室倫理委員會制定的原則在特殊無菌的條件下進行喂養(yǎng)。成瘤時,先用含5×109/L肝癌細胞Huh7的PBS 注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下(同樣的實驗重復3次),1周后當瘤塊長到80-100 mm3, 裸鼠隨機的分組(每組5只),用含有不同濃度Fluspirilene (8、15 mg·kg-1)或5-Flurouracil(5-Flurouracil,5-FU,)(Sigma) 10 mg·kg-1[14]的0.5% CMC-NaCl進行口服灌胃21 d后,裸鼠斷頸處死。腫瘤體積用公式V= ab2/2進行計算(a=最長直徑,b=最短直徑)。實驗重復3次。

1.3.3免疫組化(immunohistochemistry，IHC) 室溫二甲苯對樣本脫蠟、水化切片、熱抗原修復、封閉非特異性位點后，滴加一抗蓋住組織，然后放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜。d 2，室溫復溫、PBS及蒸餾水沖洗后，加二抗，室溫孵育10 min后，PBS及蒸餾水沖洗。滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS及蒸餾水再沖洗。沖洗后每張切片快速滴加兩滴或者100 μL DAB溶液，染色合適即可終止染色，自來水沖洗。蘇木素復染，細胞核變藍色即可終止，自來水或者PBS沖洗還藍。1%鹽酸酒精分化后，自來水沖洗，脫水、涼干后滴加適量中性樹膠封片，蓋上蓋玻片、晾干。顯微鏡下拍照即可。實驗重復3次。

1.3.4Western blot實驗 HepG2細胞在六孔板內(nèi)用含10% FBS的 RPMI 1640 培養(yǎng)到每孔細胞長滿90%以后，倒掉培養(yǎng)基，加入含 Fluspirilene的10% FBS的 新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基，6 h后收集細胞，用含 1 mmol·L-1PMSF及蛋白酶抑制劑的RIPA buffer進行蛋白裂解后，把收集的樣本放在 4 ℃， 13 000 r·min-1，離心15 min，收集上清，用 BCA Protein Assay Kit (Thermo)進行蛋白濃度檢測。把測定濃度的蛋白樣本按不同目的濃度加入到 10% SDS-PAGE電泳液中進行目的蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗、加二抗。用ECL蛋白印跡底物(Pierce，Thermo，USA)化學發(fā)光法顯影拍照即可。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 mRNA轉(zhuǎn)錄篩查Fluspirilene處理肝癌細胞的基因差異表達我們前期試驗結(jié)果驗證了小分子化合物Fluspirilene具有強烈抗肝癌作用，但是具體分子機制不明。本實驗通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查試圖尋找Fluspirilene處理肝癌細胞的差異基因表達，結(jié)果如Tab 1所示，F(xiàn)luspirilene對Akt基因表達量呈現(xiàn)3.07倍差異。Fig 1A紅色箭頭所示，F(xiàn)luspirilene處理肝癌細胞HepG2后，差異基因分類顯示Fluspirilene對細胞增殖分化過程影響明顯。Fig 1B轉(zhuǎn)錄組熱圖顯示，F(xiàn)luspirilene對Akt基因表達量呈現(xiàn)明顯差異；Akt蛋白表達水平呈現(xiàn)明顯低表達(Fig 1C)。

Tab 1 Quantity of gene expression on Fluspirilene treatment HCC cells

Fig 1 Effect of Fluspirilene treatment on HCC cells

2.2 Fluspirilene對BALB/C移植瘤裸鼠治療效果為了觀察Fluspirilene對動物體內(nèi)瘤體的抑制作用，通過對 BALB/C裸鼠皮下注射肝癌細胞Huh7成瘤實驗后,進行隨機分組(每組6只),通過口服灌胃21 d含不同劑量Fluspirilene (8、15 mg·kg-1)的0.5% CMC-NaCl。同時比較了5-Fu (10 mg·kg-1)對BALB/C裸鼠移植瘤的治療效果。我們的結(jié)果如Fig 2所示，當治療21 d后，與對照組相比，F(xiàn)luspirilene治療組強烈的抑制了腫瘤的生長，且腫瘤瘤體重量及體積呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用。且與臨床常用抗肝癌藥物5-Fu呈現(xiàn)相同的抑制腫瘤的效果。

Fig 2 Effect of Fluspirilene treatment on HCC

2.3 Fluspirilene對腫瘤組織蛋白水平的影響Fig 2實驗表明Fluspirilene處理肝癌移植瘤小鼠后腫瘤體積及重量呈現(xiàn)明顯濃度依懶性抑制趨勢。進一步瘤體組織免疫組化檢測如Fig 3所示: Fluspirilene處理肝癌移植瘤小鼠后，與對照組織相比，F(xiàn)luspirilene處理組磷酸化-Akt(phosphorylate-Akt，p-Akt)呈現(xiàn)濃度依賴性低表達(Fig 3A)。

2.4 Fluspirilene對肝癌細胞蛋白水平的影響Fig 4A、B所示，F(xiàn)luspirilene處理肝癌細胞HepG2和Huh7后，與對照組相比，F(xiàn)luspirilene處理組Akt、磷

Fig 3 Effect of protein expression of cancer tissues on HCC xenograft BALB/C nude n=3)

Fig 4 Effect of protein expression on Fluspirilene treatment HCC n=3)

Fig 5 Mechanism of Fluspirilene suppressing HCC

酸化CDK2 (phosphorylate-CDK2，p-CDK2)及磷酸化Rb(phosphorylate-Rb，p-Rb)呈明顯濃度依賴性下降趨勢。

3 討論

細胞周期紊亂是惡性腫瘤的特征之一。CDKs作為細胞周期檢測點的重要調(diào)控因子，對細胞周期各時相有序進行起著重要調(diào)控作用。CDK2 與CyclinE形成細胞周期激酶復合物可磷酸化激活Rb，為G1期轉(zhuǎn)換到S 期的起著關(guān)鍵調(diào)控作用[4-6]。因此抑制CDK2活性可以抑制腫瘤細胞惡性增殖[7]。

Akt激酶是一種重要的蛋白激酶，在生理和病理方面都能夠通過磷酸化下游底物蛋白和轉(zhuǎn)錄因子來影響細胞生長、細胞遷移、腫瘤發(fā)生等許多重要的生理功能。Akt激酶屬于AGC激酶家族，它由3個保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別是：N端的PH結(jié)構(gòu)域、中央激酶催化亞基結(jié)構(gòu)域和1個含有調(diào)節(jié)疏水基序的C-末端。Akt激酶是細胞內(nèi)重要的調(diào)控蛋白，Akt的活性與其自身的磷化、去磷酸化密切相關(guān)。當細胞分裂素、細胞因子等刺激時，Akt與PI3K結(jié)合并被招募到細胞膜上，然后被蛋白激酶1(PDK1)和mTORC2激活Akt磷酸化位點。激活的Akt進一步磷酸化其下游的底物，進而發(fā)揮不同的生物學功能。PI3K / Akt / mTOR 信號通路對肝臟惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、存活和腫瘤的形成起到重要調(diào)控作用[15]。高表達Akt、mTOR與肝癌患者預后呈現(xiàn)直接相關(guān)[16]。活化后的Akt參與細胞周期、腫瘤細胞生存等細胞重要進程[17-18]。

本團隊前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fluspirilene下調(diào)了CDK2蛋白表達水平，阻滯了細胞周期G1期，從而抗肝癌細胞增殖作用[12]，但是其具體分子機制不明。為了探索小分子化合物Fluspirilene與活化后的Akt激酶調(diào)控腫瘤細胞周期G1期影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本實驗進行了如下研究。首先通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查發(fā)現(xiàn)：Fluspirilene處理肝癌細胞后Akt基因呈現(xiàn)3.07倍差異表達，進一步蛋白實驗驗證了其差異表達(Fig 1)。據(jù)此，本實驗推測Fluspirilene有可能通過抑制了CDK2的上游通路Akt激酶的活性，從而降低了CDK2的活性，阻滯了細胞周期G1期抗肝癌作用。為了驗證本假設(shè)，本團隊進一步進行了動物實驗，結(jié)果表明：與對照組相比，F(xiàn)luspirilene治療組強烈的抑制了腫瘤的生長，且腫瘤瘤體重量及體積呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用(Fig 2)。為了驗證Fluspirilene抗肝癌是通過抑制了Akt激酶活性抗肝癌的假設(shè)，接下來對動物瘤體組織進行免疫組化檢測，結(jié)果表明：p-Akt蛋白呈現(xiàn)濃度依賴性低表達(Fig 3)。又為了驗證Fluspirilene通過抑制了CDK2上游通路Akt激酶的活性，而下調(diào)了CDK2的活性達到阻滯細胞周期G1的假設(shè)，進一步通過Western blot實驗處理肝癌細胞，檢測結(jié)果表明：Fluspirilene治療組Akt、p-CDK2、p-Rb蛋白表達水平呈現(xiàn)明顯濃度依賴性下降(Fig 4)。

本實驗通過體內(nèi)外分子生物功能實驗驗證了Fluspirilene抗肝癌的作用，并推測小分子化合物Fluspirilene可能通過下調(diào)Akt活性，干預下游CDK2/Rb細胞周期信號分子通路, 阻滯細胞周期G1期，從而抑制肝癌細胞增殖作用(Fig 5)。通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查熱圖(Fig 1)顯示Fluspirilene處理肝癌細胞后同時有幾個基因都有差異表達，我們推測Fluspirilene抗肝癌作用可能通過一個復雜的分子信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)而實現(xiàn)的，這部分的假設(shè)將是本團隊接下來將要深入探討的內(nèi)容。