辛二酰苯胺異羥肟酸舒張大鼠離體胸主動脈作用和機制

謝 童，李發珍，張成瑞，范彥英，楊彩紅

(山西醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，山西 太原 030001)

近年來，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)廣泛用于臨床治療腫瘤，目前HDACI按化學結構主要分為四類，分別為短鏈脂肪酸類、苯胺類、異羥肟酸類和親電酮類等[1]。根據藥物的結構改造，合成的辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)成為首個獲得批準上市的HDACI，通用名稱為伏立諾他，臨床上主要用于T細胞淋巴瘤的治療[2-3]。在心血管方面，近年研究發現HDACI可以改善動脈粥樣硬化、高血壓和肺動脈高壓、心肌梗死等心血管疾病的發生發展過程[4]，但SAHA對血管的作用機制目前尚不明確，本文旨在探討SAHA對大鼠離體胸主動脈的作用，研究內皮舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列環素(prostacyclin，PGI2)以及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Ca2+在SAHA舒張血管中的作用，以求豐富SAHA在血管方面的藥理學資料，期望為心血管疾病的治療找到新方法。

1 材料與方法

1.1 動物清潔級SD♂大鼠，體質量(300±25)g，大鼠飼養條件：溫度(22±2) ℃，濕 度(45%-60%)，光、暗每12 h循環1次，自由飲食與飲水。獲自山西醫科大學實驗動物中心(許可證號SCXK(晉)2009-0001)。

1.2 試劑SAHA(批號0510B022)、氯化乙酰膽堿(acetylcholine chloride，ACh，批號323D011)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，批號520C0314)和乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethyleneglycol bis (2-aminoethylether) tetraacetic acid，EGTA，批號526E052]均購自北京索萊寶科技有限公司，吲哚美辛(indomethacin，Indo，批號056M4036V)、佛波酯(phorbol ester，PMA，批號MKBX7267V)和左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitroarginiemethylester，L-NAME，批號WXBC4975V)均購自美國Sigma公司。十字孢堿(staurosporine，SP，批號21226)購自MedChemExpress公司，重酒石酸去甲腎上腺素(norepinephrine，NE，批號1806141)購自天津金耀氨基酸有限公司，苯腎上腺素(phenylephrine，PE，批號H1816053)購自上海晶純生化科技股份有限公司。生理鹽溶液成分(mmol·L-1)：NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，葡萄糖11.1，HEPES 5。60 mmol·L-1KCl溶液成分(mmol·L-1)：NaCl 89.6，KCl 60，CaCl22.5，MgCl21.2，葡萄糖11.1，HEPES 5。現配現用，使用前pH值調節為7.4，溫度調為37 ℃。其余試劑均為國產分析純。

1.3 儀器PowerLab 8/30信號分析系統購自澳大利亞埃德公司；HYJ-501S超級恒溫水槽購自上海躍進醫療器械有限公司；CP124C電子天平購自奧豪斯儀器(常州)有限公司；SV-8離體組織器官灌流系統購自四川泰盟科技有限公司；雷磁pH計購自上海儀電科學儀器有限公司。

1.4 方法[5-8]

1.4.1大鼠離體胸主動脈環制備與內皮功能測定 斷頭處死300 g左右的SD♂大鼠，從心臟方向分離出整條胸主動脈，置于4 ℃ pH值為7.4的生理鹽溶液中，快速分離血管周圍結締組織，均勻分成每段約3-4 mm長的血管環，用自制棉棒在血管環內壁輕輕摩擦3-4次即可制成去內皮胸主動脈環。用自制的三角形細鋼絲掛鉤輕輕穿過血管將其固定，然后再用自制的L形細鋼絲再次輕輕穿過血管管腔，水平懸掛于充滿5 mL 37 ℃ pH值為7.4的生理鹽溶液的浴管中，上方連接張力轉換器，下方固定于浴管底部，浴管內持續通入100% O2，調節血管前負荷為2 g，每15 min更換生理鹽溶液1次，重新調節血管前負荷為2 g，經過4次共60 min后血管基礎張力穩定在2 g左右，然后用5 mL 37 ℃ pH值為7.4的60 mmol·L-1KCl溶液替換浴管中的生理鹽溶液，刺激血管收縮，每15 min更換1次KCl溶液，使血管收縮達到坪值，KCl收縮2次的幅度差值低于5 %說明血管活性良好。KCl收縮完后重新更換為新鮮的生理鹽溶液，用1 μmol·L-1PE收縮血管，穩定后用10 μmol·L-1ACh舒張，以ACh舒張幅度比PE收縮幅度作為舒張率，如果舒張率高于0.75即可認定血管內皮完整(endothelium-intact，End+)，如果舒張率低于0.05即可認定血管內皮完全去除(endothelium-denuded，End-)。待內皮功能檢測完，更換生理鹽溶液使血管恢復基礎狀態進行后續實驗。

1.4.2SAHA影響基礎狀態大鼠離體胸主動脈張力的測定 采用內皮完整的大鼠胸主動脈環，實驗組每隔10 min依次加入SAHA系列藥物溶液，使其終濃度分別達到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1，對照組加入等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO，觀察SAHA累積加藥實驗組與溶劑對照DMSO組血管基礎張力的變化。

1.4.3SAHA影響KCl預收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的測定 分別用60 mmol·L-1KCl預收縮End+與End-大鼠胸主動脈環，收縮穩定后，實驗組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環的生理鹽溶液中依次加入SAHA系列藥物溶液，使其終濃度分別達到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1，對照組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環的生理鹽溶液中加入等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO。以KCl預收縮血管達到的最大收縮幅度為1，分別計算End++SAHA組、End-+SAHA組、End++DMSO組和End-+DMSO組中SAHA與DMSO各個累積濃度下的舒張幅度在 KCl最大收縮幅度中所占比例。

1.4.4SAHA影響NE預收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的測定 分別用1 μmol·L-1NE預收縮End+與End-大鼠胸主動脈環，收縮達坪值后，實驗組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環的生理鹽溶液中依次加入SAHA系列藥物溶液，使其終濃度分別達到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1，對照組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環的生理鹽溶液中加入等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO。以NE預收縮血管達到的最大收縮幅度為1，分別計算End++SAHA組、End-+SAHA組、End++DMSO組和End-+DMSO組中SAHA與DMSO各個累積濃度下的舒張幅度在 NE最大收縮幅度中所占比例。

1.4.5L-NAME和Indo影響SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的測定 分別使用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和環氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑L-NAME與Indo預處理內皮完整的大鼠胸主動脈環，實驗組分別孵育0.1 mmol·L-1L-NAME和0.01 mmol·L-1Indo 30 min，SAHA對照組不孵育L-NAME和Indo，然后3組均用1 μmol·L-1NE預收縮血管，穩定后每隔10 min依次加入SAHA系列藥物溶液使其分別達到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1的終濃度，分別計算End++SAHA+L-NAME組、End++SAHA+Indo組和End++SAHA組中SAHA各個累積濃度下的舒張幅度在NE最大收縮幅度中所占比例。

1.4.6PMA和SP影響SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的測定 分別使用PKC激動劑PMA和PKC抑制劑SP預處理內皮完整的大鼠胸主動脈環，實驗組分別孵育0.1 μmol·L-1PMA和0.01 μmol·L-1SP 30 min，SAHA對照組不孵育PMA和SP，然后3組均用1 μmol·L-1NE預收縮血管，穩定后每隔10 min依次加入SAHA系列藥物溶液使其分別達到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1的終濃度，分別計算End++SAHA+PMA組、End++SAHA+SP組和End++SAHA組中SAHA各個累積濃度下的舒張幅度在NE最大收縮幅度中所占比例。

1.4.7測定SAHA對外鈣內流和內鈣釋放誘導大鼠離體胸主動脈收縮的影響 采用內皮完整的大鼠胸主動脈環，基礎狀態穩定后，用含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液替換浴管內正常含Ca2+的生理鹽溶液，以此來螯合血管的細胞外鈣，20 min后重新更換為不含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液，穩定后用1 μmol·L-1NE預收縮血管，此時血管通過細胞釋放的Ca2+而引起收縮，收縮穩定后加入CaCl2系列溶液，使其終濃度分別達到0.03、0.1、0.3、1和3 mmol·L-1，由于細胞外鈣內流，血管收縮增強，當血管收縮達到坪值后，用含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液替換浴管內液體，以此來絡合細胞外鈣，20 min后再重新更換為不含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液，實驗組分別孵育0.1、1和10 μmol·L-1SAHA 30 min，對照組孵育等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO 30 min，然后各組加入1 μmol·L-1NE預收縮血管，收縮穩定后各組依次加入CaCl2系列溶液使其終濃度分別達到0.03、0.1、0.3、1和3 mmol·L-1，比較實驗組孵育0.1、1和10 μmol·L-1SAHA和對照組孵育DMSO前后CaCl2和NE收縮幅度變化，以孵育之前CaCl2和NE的最大收縮幅度為1，分別計算孵育之后累積濃度CaCl2和NE的收縮率，觀察SAHA對血管外Ca2+內流和細胞內Ca2+釋放的影響。

2 實驗結果

2.1 SAHA對基礎狀態大鼠離體胸主動脈張力的作用如Fig 1所示，累積濃度SAHA(0.3、1、3、10和30 μmol·L-1)不改變基礎狀態大鼠離體胸主動脈環張力。

2.2 SAHA對KCl預收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的作用SAHA可以舒張KCl預收縮的End+(Fig 2A)與End-(Fig 2B)胸主動脈，最大濃度SAHA對KCl預收縮的End+與End-胸主動脈的舒張率分別為(0.124±0.013)和(0.065±0.013)，差異有統計學意義(P<0.01)，對End+胸主動脈舒張率高于End-胸主動脈(Fig 2C)。

2.3 SAHA對NE預收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的作用從Fig 3可以看出，SAHA可以濃度依賴性的舒張NE預收縮的End+(Fig 3A)和End-(Fig 3B)胸主動脈，最大舒張率分別為(0.656±0.06)和(0.320±0.014)，對End+胸主動脈舒張率高于End-胸主動脈(Fig 3C)，結果差異具有統計學意義(P<0.01)。

Fig 1 Effect of SAHA on basal tension of isolated thoracic aorta rings of rats n=6)

2.4 L-NAME和Indo對SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的影響如Fig 4A所示，L-NAME (0.1 mmol·L-1)和Indo (0.01 mmol·L-1)預處理實驗組與SAHA對照組相比，L-NAME和Indo預處理組SAHA各個累積濃度下對NE預收縮血管的舒張明顯減小，End++SAHA+L-NAME組、End++SAHA+Indo組和End++SAHA組中SAHA的最大舒張率分別為(0.301±0.04)、(0.552±0.05)和(0.623±0.05)，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明預孵L-NAME和Indo可以減弱NE預收縮下SAHA的血管舒張作用，揭示SAHA舒張血管可能與增加內皮舒張因子NO和PGI2生成有關。

2.5 PMA和SP對SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的影響從Fig 5A可以看出，預孵PKC抑制劑SP(0.01 μmol·L-1)可以促進SAHA的血管舒張作用，End++SAHA+SP組與End++SAHA組最大舒張率分別為(0.797±0.06)和(0.650±0.03)，差異有統計學意義(P<0.01)。而預孵PKC激動劑PMA(0.1 μmol·L-1)能抑制SAHA舒張血管，但是隨著SAHA累積濃度的增大，PMA的抑制作用減弱，在SAHA濃度累積達到30 μmol·L-1時，無抑制作用。結果說明SAHA舒張血管作用可能部分與PKC有關。

Fig 2 Effect of SAHA on End+ and End- isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with KCl n=6)

2.6 SAHA對外鈣內流和內鈣釋放誘導大鼠離體胸主動脈收縮的影響如Fig 6A所示，孵育1和10 μmol·L-1SAHA 均能顯著抑制累積濃度CaCl2(0.03、0.1、0.3、1和3 mmol·L-1)在無鈣生理鹽溶液中引起的血管收縮，最大收縮率分別為(0.804 ± 0.04)和(0.600±0.04)，與溶劑對照DMSO組收縮率(0.928 ± 0.05)比較，具有統計學差異(P<0.01)。而低濃度SAHA(0.1 μmol·L-1)在CaCl2累積濃度達到3 mmol·L-1時就不能發揮抑制作用。預孵0.1、1和10 μmol·L-1SAHA也能顯著抑制無鈣液中NE誘導的血管收縮(Fig 6B)，收縮率分別為(0.275 ± 0.03)、(0.172 ± 0.029)和(0.108 ± 0.04)，與溶劑對照DMSO組收縮率(0.734±0.07)比較，結果差異具有統計學意義(P<0.01)。提示一定濃度下SAHA舒張血管可能與抑制外鈣內流和內鈣釋放有關。

3 討論

由于心血管疾病嚴重影響患者的生活質量,抑制組蛋白去乙酰化酶漸成為心血管疾病領域研究熱點。為了進一步豐富SAHA在血管方面的藥理學資料，本文在離體條件下探究了SAHA對大鼠胸主動脈的作用，發現其能舒張血管，并初步研究了SAHA的舒張機制。

研究發現，血管內皮細胞能夠分泌產生多種調節血管收縮與舒張功能的活性物質，其中內皮型一氧化氮合酶合成的NO和COX合成的PGI2是兩種重要的血管內皮舒張因子[9]。NO和PGI2分別活化血管平滑肌細胞內的鳥苷酸環化酶和腺苷酸環化酶，使胞質中環鳥苷酸和環腺苷酸水平升高，胞內鈣離子濃度降低，進而舒張血管[10]。實驗結果表明SAHA對完整內皮血管的舒張要強于去內皮血管，具有內皮相關性，使用NOS和COX抑制劑L-NAME與Indo預孵血管后，發現SAHA的舒張作用明顯減弱，表明SAHA舒張血管可能與增加內皮舒張因子NO和PGI2生成有關。

Fig 3 Effect of SAHA on End+ and End- isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with NE n=6)

另外，PKC也通過多種途徑參與血管收縮舒張的調節，一是抑制PKC可以增強內皮型一氧化氮合酶的活性，導致NO合成增加，從而引起血管發生舒張[11]。二是PKC能夠通過多種機制抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶，增強肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化，促使平滑肌收縮[12]。還有研究發現，PKC可以通過增強細胞內鈣離子的敏感性，使肌細胞膜去極化，促進鈣離子通過電壓依賴性鈣通道進入細胞，從而增強平滑肌的收縮[13]。本文應用PKC激動劑PMA孵育血管后發現SAHA的血管舒張作用降低，而使用PKC抑制劑SP則能促進SAHA舒張血管，提示SAHA舒張血管與抑制PKC活性也有關。

在血管平滑肌的收縮與舒張過程中，鈣離子的參與至關重要，細胞內鈣離子結合鈣調蛋白后活化肌球蛋白輕鏈激酶，使橫橋中的MLC磷酸化，引起橫橋肌絲滑行，從而誘發平滑肌收縮[14]。細胞內的鈣離子水平升高主要有兩個途徑，一個是細胞外鈣離子內流進入細胞，另外一個途徑是細胞內鈣庫釋放儲存的鈣離子。在本實驗中預收縮劑KCl引起血管收縮就是由于細胞外高K+使平滑肌細胞膜去極化，從而活化細胞膜上電壓依賴性鈣通道，致鈣離子內流進入細胞而收縮血管。預收縮劑NE是通過活化受體依賴性鈣離子通道，誘發外鈣內流而使血管發生收縮。在無鈣生理鹽溶液中加入累積濃度CaCl2引起血管收縮是通過增加細胞外鈣離子水平，而促進鈣離子內流引起血管收縮。實驗結果表明，累積濃度SAHA能夠舒張KCl和NE預收縮的大鼠離體胸主動脈，且抑制累積濃度CaCl2誘導的血管收縮，提示SAHA舒張血管可能與抑制外鈣內流相關。在本實驗中預收縮劑NE可以活化磷脂酶C，刺激三磷酸肌醇產生，而后者能促使肌漿網內鈣離子釋放[15]。NE在無鈣生理鹽溶液中收縮血管就是通過內鈣釋放增加鈣離子濃度，實驗結果表明隨著預孵SAHA濃度的增加，無鈣液中NE引起的收縮作用減弱，揭示SAHA舒張血管與抑制內鈣釋放也有關。

Fig 4 Effect of L-NAME and Indo on SAHA-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with NE n=6)

Fig 5 Effect of SP and PMA on SAHA-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with NE n=6)

Fig 6 Effect of SAHA on vascular contraction induced by extracellular calcium influx and intracellular calcium release n=6)

綜上所述，SAHA的血管舒張作用具有內皮相關性，可能與增加內皮舒張因子NO和PGI2生成有關，另外，其舒張血管還可能與抑制PKC活性，抑制細胞外鈣離子內流和細胞內鈣離子釋放有關。本實驗僅做了基礎性的初步研究，關于SAHA舒張血管的具體機制還有待進一步的深入研究。

(致謝：特別感謝山西醫科大學藥理教研室各位老師和同學們的幫助。)