SIRT1介導(dǎo)的七氟醚后處理對失血性休克復(fù)蘇小鼠學(xué)習(xí)與記憶損傷的保護作用

黃曉童，黃春霞，胡憲文

(麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)安徽普通高校重點實驗室，安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230601)

失血性休克是創(chuàng)傷導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一，目前通常采用快速灌注液體的方法以迅速恢復(fù)循環(huán)血容量治療失血性休克。當(dāng)采取積極措施恢復(fù)機體血供時，腦組織因其較為脆弱會受到二次損傷，稱之為腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。有研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚通過抑制凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)介導(dǎo)的大鼠全腦的缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而減輕CIRI[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulation 1，SIRT1)參與多種生物代謝活動，如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞衰老與凋亡、氧化應(yīng)激及腫瘤形成等[2-3]。有研究指出，Maresin-1治療通過激活SIRT1信號來減少炎癥反應(yīng)和線粒體損傷，從而減輕CIRI[4]。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，七氟醚后處理可能通過上調(diào)SIRT1和過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)降低氧化應(yīng)激反應(yīng)水平，從而對CIRI起到積極的保護作用[5]。然而基于SIRT1通路的七氟醚后處理腦保護作用的具體機制目前尚未有研究。本實驗擬用特異性的SIRT1抑制劑研究SIRT1在七氟醚后處理小鼠失血性休克與復(fù)蘇中的作用，以進一步探討七氟醚后處理發(fā)揮腦保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物從安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購買C57BL/6J小鼠(8-10周齡，♂)進行實驗，動物使用許可證號是SYXK(皖)2017-006。

1.2 試劑七氟醚(艾伯維公司，83291)，EX527(美國Sigma公司，E7034-5MG)，TTC染料(美國Sigma公司,T8877)，BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA(碧云天生物技術(shù)有限公司，P0012,P0013K),SIRT1抗體(Cell Signaling Technology,9475S)，Bax抗體(Cell Signaling Technology,2772S)，Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology，3498S)，Cleaved-caspase-3抗體(Cell Signaling Technology,9664S)，ECL顯影液(美國Thermo Fisher Scientific公司,32109)，β-actin抗體(中杉金橋生物技術(shù)有限公司,TA-09), TUNEL試劑盒(羅氏公司,12156792910)。

1.3 儀器七氟醚蒸發(fā)罐(Grager公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)，動物行為視頻分析系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，RSP01-C單通道雙向推拉注射泵(嘉興貝塔儀器有限公司)，麻醉氣體檢測儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.4 動物分組、模型建立及給藥根據(jù)隨機數(shù)據(jù)表法將小鼠分為5組(每組15只):假手術(shù)組(Sham組)、失血性休克與復(fù)蘇組(Shock組)、七氟醚組(Sevo組)、SIRT1特異性抑制劑EX527+七氟醚組(EX527+Sevo組)、SIRT1特異性抑制劑EX527組(EX527組)。Sham組僅進行右側(cè)頸總動脈、頸靜脈置管，不進行抽血。Shock組分離出右頸總動脈和頸靜脈后，分別向近心端置入PE10管。經(jīng)頸靜脈輸注肝素300 U·kg-1，觀察10 min后，利用輸液泵將小鼠總血容量50%的血液在30 min內(nèi)經(jīng)右頸總動脈勻速抽出，抽出的血液存儲于無菌2 mL注射器中。1 h后，將血30 min內(nèi)回輸，建立失血性休克與復(fù)蘇模型。Sevo組先建立失血性休克模型，在回輸血液即刻吸入2.4%七氟醚。小鼠體溫在實驗過程中維持在37 ℃左右。EX527+Sevo組在動靜脈置管前30 min經(jīng)腹腔注射SIRT1特異性抑制劑EX527 10 mg·kg-1，其余操作同Sevo組。EX527組在動靜脈置管前30min經(jīng)腹腔注射SIRT1特異性抑制劑EX527 10 mg·kg-1。

1.5 小鼠空間與學(xué)習(xí)記憶能力測定、逃避潛伏期實驗以及空間探索實驗各組小鼠于術(shù)后d 4-10進行水迷宮實驗。將小鼠面向池壁放入水中，放入位置隨機?、瘛ⅱ?、Ⅲ、Ⅳ四個象限之一，在60 s內(nèi)找到平臺的時間為逃避潛伏期(escape latency period)。動物行為視頻分析系統(tǒng)追蹤小鼠的運動軌跡，記錄小鼠尋找平臺的時間(潛伏期)。每只小鼠每天進行4次訓(xùn)練，兩次實驗間隔15-20 min，當(dāng)日成績?yōu)?次成績的平均值，連續(xù)6 d，實驗于每天14 ∶00-18 ∶00之間進行。另外，觀察小鼠60 s內(nèi)在目標(biāo)象限游泳的路程。

1.6 TTC染色水迷宮實驗結(jié)束后(術(shù)后d 10)取腦組織切片行TTC 染色，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。簡而言之，將腦切片在2%的2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)中染色，并在37 ℃下孵育30 min。然后，將腦切片在4%多聚甲醛中固定24 h。使用光學(xué)顯微鏡(Olympus Corporation)捕獲圖像。白色區(qū)域為梗死區(qū)域，紅色區(qū)域為正常區(qū)域。計算公式為：梗死體積比例/%=[(梗死面積×2 mm)/(2×全腦面積×2 mm)]×100%。

1.7 TUNEL染色水迷宮實驗結(jié)束后(術(shù)后d 10)取腦組織做冰凍切片，進行TUNEL染色，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。將冰凍切片放入PBS液中清洗，滲透反應(yīng)液冰上反應(yīng)5 min，放入PBS液中清洗，滴加混合反應(yīng)液后置于37 ℃保溫箱中反應(yīng)120 min，放入PBS液中清洗，DAB顯色，脫水，封片，各組動物每張切片取海馬CA1區(qū)視野，在顯微鏡下觀察TUNEL染色陽性細(xì)胞。

1.8 Western blot法水迷宮實驗結(jié)束后(術(shù)后d 10)，取海馬組織勻漿，于4 ℃下13 200 r·min-1離心30 min，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白含量，取50 μg樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日加入二抗，室溫孵育2 h。凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過ImageJ軟件測定蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠潛伏期比較如Fig 1所示，從d 5開始，Sevo組和Sham組小鼠的潛伏期明顯短于Shock組(P<0.05)。EX527和Sevo聯(lián)合處理可延長小鼠的潛伏期，此外，我們發(fā)現(xiàn)Sham組和EX527處理組小鼠的潛伏期差異無顯著性。

Fig 1 Comparison of latency period in five

2.2 各組小鼠目標(biāo)象限路程比較如Fig 2所示，Sevo組和Sham組小鼠的目標(biāo)象限路程明顯長于Shock組(P<0.05)，EX527+Sevo組小鼠的目標(biāo)象限路程較Sevo組相比明顯縮短(P<0.05)，Sham組與EX527組小鼠目標(biāo)象限時間百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組小鼠腦梗死體積比較TTC染色實驗結(jié)果顯示：Shock組與EX527+Sevo組小鼠的腦梗死體積明顯增加，而Sevo處理后腦梗死體積明顯降低。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，與單純的Sevo組相比，EX527+Sevo組小鼠腦梗死體積增加(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 2 Comparison of path of crossing originplatform quadrant in each

Fig 3 Effects of sevoflurane postconditioningon infarct size of brain in

2.4 各組小鼠TUNEL染色結(jié)果比較TUNEL染色結(jié)果顯示：Shock組與EX527+Sevo組小鼠的TUNEL染色陽性細(xì)胞增多，而Sevo處理后TUNEL染色陽性細(xì)胞減少。同時，與單純的Sevo組相比，EX527+Sevo組小鼠TUNEL染色陽性細(xì)胞增多，見Fig 4。

Fig 4 TUNEL staining results of mice in each group(×300)

Fig 5 Effects of sevoflurane postconditioning on expressionof SIRT1 and Bax, Bcl-2,

2.5 SIRT1和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況我們采用Western blot對各組小鼠腦組織中相關(guān)蛋白進行了檢測，結(jié)果顯示：與Sham組比較，Shock組SIRT1、抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。此外，Sevo組與Shock組相比，小鼠腦組織中SIRT1蛋白表達(dá)水平和Bcl-2的表達(dá)水平升高(P<0.05)，而Bax、Cleaved-caspase-3表達(dá)下降(P<0.05)。

3 討論

CIRI是指缺血腦組織在一定的時間內(nèi)恢復(fù)血供時，不僅沒有恢復(fù)正常腦功能，反而加重腦損傷。急性重度失血性休克和再灌注會導(dǎo)致神經(jīng)元嚴(yán)重的損害。CIRI涉及多種機制，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、興奮性氨基酸/氧自由基、線粒體損傷、鈣超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[6-7]。有文章提出橄欖苦苷(Oleuropein, OL)通過上調(diào)凋亡重要標(biāo)志物Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax的表達(dá)來發(fā)揮抗凋亡作用，是一種潛在的腦卒中治療方法[8]，這為我們的實驗設(shè)計也提供了思路。Zhang等[9]的研究指出，七氟烷處理可以明顯的改善IRI動物模型后小鼠的記憶和學(xué)習(xí)功能，這與我們的七氟烷后處理失血性休克復(fù)蘇小鼠在Morris水迷宮實驗中的結(jié)果一致，其主要表現(xiàn)為小鼠逃避潛伏期明顯縮短，且活動路程減少。同時，我們發(fā)現(xiàn)七氟醚后處理可以明顯減少CIRI引起的腦梗死體積，說明七氟醚具有一定的神經(jīng)保護作用。

SIRT1蛋白在多數(shù)生物活動中具有不可或缺的作用。SIRT1介導(dǎo)的信號通路與改善學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能密切相關(guān)。近年來研究表明， SIRT1是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心靶點，其在調(diào)控細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡等方面均發(fā)揮著重要作用[10]。在局灶性腦缺血中，敲除大鼠SIRT1后，腦梗死面積增大[11]。研究中發(fā)現(xiàn)SIRT1可以調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞中的能量代謝，通過抑制IRI后的線粒體損傷，從而對視網(wǎng)膜細(xì)胞起到IRI后的保護作用[12]。神經(jīng)元細(xì)胞是完全依靠線粒體提供的ATP來維持其神經(jīng)活性和功能，因此線粒體功能紊亂程度與神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)[13]。凋亡刺激會導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜上的非特異通道m(xù)PTP開放[14]，而mPTP開放則被認(rèn)為是線粒體功能障礙的最初原因之一[15]。我們發(fā)現(xiàn)SIRT1在七氟烷處理之后的小鼠腦組織中的蛋白表達(dá)水平明顯提高，此前有研究表明，小鼠IRI手術(shù)處理之后的腦組織中SIRT1的表達(dá)水平明顯降低[16]，而進一步促進SIRT1的表達(dá)則會明顯減輕IRI導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，充分證明了SIRT1參與了七氟烷后處理對失血性休克復(fù)蘇小鼠學(xué)習(xí)與記憶損傷的保護作用。

有研究指出，IRI帶來的炎癥損傷可以明顯促進小鼠神經(jīng)元的凋亡[10]。在腦缺氧缺血及再灌注過程中，細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元受損的主要形式之一，而Bcl-2和Bax是凋亡家族中調(diào)控細(xì)胞凋亡的兩個主要基因，其中Bcl-2作為典型的抗凋亡蛋白而Bax作為促凋亡蛋白，兩者的異常表達(dá)與凋亡調(diào)控及凋亡嚴(yán)重程度直接相關(guān)[17]。在Wang等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1過表達(dá)會抑制PC12細(xì)胞在氧糖剝奪復(fù)氧(OGD/R)處理之后的Bax表達(dá)和caspase-3蛋白的激活。然而在Chai等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1會促進Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。類似的，我們發(fā)現(xiàn)IRI之后，SIRT1和Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，而Bax和caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯提高，說明IRI會明顯促進神經(jīng)元凋亡，但是進一步使用七氟烷處理則會明顯促進SIRT1的表達(dá)而抑制神經(jīng)元的凋亡，這與之前的文獻(xiàn)報道一致[10]。SIRT1 介導(dǎo)的信號通路起著非常重要的作用，我們進一步使用SIRT1特異性抑制劑EX527抑制七氟烷處理后小鼠中SIRT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織中的梗死面積又具有明顯的升高，同時，小鼠到達(dá)Morris水迷宮平臺的潛伏期明顯增加，且活動路程明顯增加。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚后處理可能通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕CIRI損傷， PI3K/Akt/eNOS是體內(nèi)細(xì)胞信號傳導(dǎo)的常見通路，在調(diào)控細(xì)胞的周期活動、啟動細(xì)胞凋亡、促進新生血管的生成和調(diào)節(jié)端粒酶的活性等許多方面均發(fā)揮了重要作用。我們發(fā)現(xiàn)SIRT1可以通過NF-kB信號通路調(diào)控PI3K的磷酸化，從而促進Akt/eNOS信號通路的激活，PI3K/Akt通路參與了七氟醚后處理的神經(jīng)保護作用并已被證明在減輕細(xì)胞損傷的機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，eNOS作為下游分子在維持血管正常功能、血流量以及預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞損傷方面扮演了重要的功能，并且參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，具有抗細(xì)胞凋亡作用[18]。本研究結(jié)果表明，七氟醚后處理可提高失血性休克復(fù)蘇小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，減輕IRI損傷所致的腦梗死，增加海馬組織中SIRT1和Bcl-2的表達(dá)，減少促凋亡蛋白的表達(dá)。與Sevo組相比，EX527+Sevo組小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力明顯下降，腦梗死體積也明顯增加，而SIRT1與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)卻無差異，可能是因為實驗周期略長，小鼠體內(nèi)的EX527被完全代謝，對SIRT1的抑制作用消失甚至出現(xiàn)反跳現(xiàn)象。我們后期會進行急性期的實驗以對本實驗結(jié)果進一步驗證。本實驗結(jié)果提示，SIRT1可能介導(dǎo)了七氟醚后處理對失血性休克復(fù)蘇小鼠的腦保護作用，并通過抑制凋亡發(fā)揮作用。