七氟醚預處理通過升高血漿脂聯素水平保護心肌缺血/再灌注損傷

翟津津，孫一愷，劉彥宏，楊保仲，張彥清

(山西醫科大學 1.麻醉學院, 2.附屬第一醫院麻醉科,3.研究生處，山西 太原 030001)

心外科冠脈再通手術中，心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia-reperfusion,MI/R)是無法避免的環節，而MI/R損傷是引起術后病人心功能不全和心力衰竭的重要因素[1]。因此，如何預防和治療MI/R損傷就變得尤為重要。

大量研究表明，揮發性麻醉藥(七氟醚，異氟醚等)預處理和后處理可以減少MI/R損傷[2-3]，然而其作用的分子機制尚未闡明。我們前期研究發現，小凹蛋白-3(caveolin-3，cav-3)在七氟醚心肌保護中發揮著重要作用[4]。cav-3可以和脂聯素受體直接結合，是脂聯素下游信號的關鍵分子[5]，脂聯素是一種主要由脂肪細胞分泌的細胞因子，大量數據表明脂聯素對心臟具有直接的保護作用[6-7]，循環脂聯素濃度與心血管疾病關系密切相關[8-9]。但脂聯素是否參與七氟醚預處理的心臟保護作用，目前尚不清楚。

本研究觀察脂聯素在七氟醚預處理的MI/R保護中的作用，有助于闡明七氟醚預處理的心肌保護作用機制，可望為揮發性麻醉藥輔助心肌梗死患者血管再通手術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料動物 健康成年SPF級雄性C57小鼠30只，鼠齡8-10周，體質量(20-25) g，購自山西醫科大學動物實驗中心[許可證號SCXK(晉)2015-0001]。健康成年SPF雄性脂聯素基因敲除鼠，10只，鼠齡8-10周，體質量(20-25) g，由上海南方模式生物科技有限公司提供。

主要藥品和試劑 七氟醚，規格：100 mL，購自上海恒瑞醫藥有限公司；伊文思藍(Evans blue)，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，均購自上海生工生物工程有限公司; 蘇木素-伊紅(HE) 染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠脂聯素酶聯免疫雙抗夾心法試劑盒，購自美國博士德生物工程有限公司(EK0596)。主要儀器 Harvard小動物呼吸機，美國Harvard產品。Power PAC1000電泳儀、半干式轉印儀以及酶標儀美國，均為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備 七氟醚預處理：將單只小鼠放入麻醉罐中，向麻醉罐中通入2%七氟醚-93%氧氣-5% CO2，10 min后，通入95%氧氣-5%CO2，15 min 后換回2%七氟醚-93%氧氣-5% CO2，如此循環3次。對照處理組通入95%氧氣-5%CO275 min，預處理結束后，立即行MI/R造模手術或假手術。

MI/R模型建立：小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后固定于實驗臺上，直視下氣管插管，連接小動物呼吸機，在左側第四、五肋間行縱行切口，暴露心臟，左心耳下緣2 mm處穿針結扎。若看到左心室前壁以及心尖發白，表明結扎位置正確，則在缺血30 min后，松開結扎線，使血流重新灌注，關閉胸腔，模型建立完畢。假手術模型只穿線不結扎，其余操作同MI/R組。

1.2.2超聲心動圖檢測 再灌注24 h后，行心臟超聲檢測前，用脫毛劑將小鼠胸部脫毛備皮。檢測時，將小鼠用異氟醚和氧氣混合吸入麻醉，置于恒溫檢測臺上，設置40 ℃，小鼠四肢用膠布固定。胸前和超聲探頭涂抹電容膠，進行M型超聲檢測。檢測左心室射血分數、左心室收縮末期內徑和左心室舒張末期內徑。

1.2.3心肌伊文思藍-TTC染色 再灌注24 h后，再次結扎左冠狀動脈，將0.2 mL 2%伊文思藍從左側頸靜脈注入，觀察小鼠四肢和嘴唇發青時，迅速摘取心臟，生理鹽水沖洗干凈血漬，濾紙吸干多余水分，剪掉多余組織，放入-20 ℃冰箱冰凍10 min，取出，均勻切片1 mm，放入2%TTC溶液中，于37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，將切片置于4%多聚甲醛固定24 h，拍照。ImageJ圖像分析軟件分析梗死面積。

1.2.4心肌Tunel染色 心肌組織經常規甲醛固定、石蠟包埋、切片，將石蠟切片常規脫蠟，采用末端脫氧核苷基轉移酶介導的dUTP原位平端標記法染色檢測細胞凋亡。染色結束后，顯微鏡下觀察并拍照，結果以Tunel陽性細胞核/總細胞核×100%表示。

1.2.5血漿脂聯素水平檢測 頸總動脈采血，4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min后，取上清，嚴格按照試劑盒說明測定脂聯素水平。

2 結果

2.1 各組小鼠術后24 h心臟功能比較在麻醉狀態測定的各項指標顯示：與假手術組相比，MI/R手術后模型組小鼠的射血分數降低(Fig 1B,P<0.05)，左心室舒張末期內徑(Fig 1C)以及收縮末期內徑(Fig 1B)增加；與模型組比較，預處理組各項指標均改善(Fig B，P<0.05)；相比預處理組，敲基因預處理組七氟醚預處理改善作用降低(Fig 1B-D)。

Fig 1 Heart function after MI/R improved by sevoflurane pretreatment

Fig 2 Area of cardiac infarction after MI/R reduced by sevoflurane pretreatment

2.2 各組小鼠術后24 h后心肌梗死面積比較術后24 h后，對各組小鼠進行伊文思藍-TTC染色，結果如Fig 2A所示，相比于假手術組，模型組心臟缺血區出現明顯壞死區；對比于模型組，預處理組心梗面積減少(P<0.05)；與野生鼠組相比，敲基因七氟醚預處理減少心梗面積的作用減弱。

2.3 各組小鼠24 h后缺血區心肌組織細胞凋亡比較對各組小鼠缺血區心肌組織進行Tunel染色，觀察七氟醚預處理對心肌MI/R后心肌細胞的影響。與假手術組相比，模型組凋亡細胞數目增加(P<0.05)；相比于模型組，預處理組凋亡細胞數目減少(P<0.05)，同時，敲基因預處理組七氟醚預處理降低凋亡細胞的作用減弱。

2.4 各組小鼠血漿脂聯素水平比較對各組小鼠血清脂聯素進行檢測，結果如Fig 4所示，相比于假手術組，模型組血漿脂聯素水平明顯降低(P<0.05)；七氟醚預處理顯著增加血漿脂聯素水平。

3 討論

七氟醚是臨床上應用最為廣泛的一種吸入揮發性氣體麻醉藥，其預處理和后處理對心肌的保護作用已得到廣泛認可[2-3]。Zhao等[10]發現，在cav-3基因敲除的小鼠，七氟醚預處理的心肌保護作用降低。脂聯素是一種主要由脂肪組織分泌的細胞因子，具有直接的心肌保護作用[6, 11]。Wang等[5]發現，cav-3在脂聯素跨膜信號傳導和抗缺血心臟保護作用中起著至關重要的作用。Cav-3在七氟醚對MI/R的心肌保護作用和脂聯素心肌保護作用中均發揮關鍵性作用，提示七氟醚對MI/R的心肌保護可能是通過對脂聯素表達水平的調控來發揮作用的。關于脂聯素是否參與七氟醚預處理的心肌保護作用目前未見報道。本研究通過使用野生型和脂聯素基因敲除小鼠，探討脂聯素在七氟醚預處理心臟保護中發揮的作用。

Fig 3 Cardiomyocyte apoptosis after MI/R reduced by sevoflurane pretreatment

Fig 4 Plasma adiponectin levels increased by sevoflurane pretreatment

MI/R是心臟外科手術中不可避免的，血液再灌注會引起缺血心臟發生一系列病理生理改變，導致心臟功能發生劇烈改變[1]，我們實驗結果同樣顯示，模型組再灌注24 h后，心臟活動功能受限，出現不可逆壞死區。揮發性氣體麻醉藥預處理和后處理在動物和人體，已經證實具有心臟保護功能[1-2, 12]；我們的實驗結果同樣證實了此結果，七氟醚預處理組，心肌凋亡細胞數目減少，梗死面積縮小，心功能改善，結果與Mathur等[13]的報道相一致。大量臨床研究和動物實驗均表明，急性心梗后血中的脂聯素水平表達減少[14-15]，而血漿脂聯素的增加可改善心肌損傷[7, 16]，與我們的實驗結果一致。通過檢測各組小鼠血漿脂聯素水平發現，對照組血漿脂聯素水平降低，同對照組相比，七氟醚預處理組血漿脂聯素水平增加。

一項回顧性Meta分析顯示，在包括糖尿病在內的許多臨床病癥中，脂聯素與死亡率之間存在正相關而非預期的負相關關系[17-18]，對脂聯素作為治療心血管疾病潛在靶點提出質疑，Scarale等對該爭議點相關的調節因子進行總結后指出脂聯素與死亡率相矛盾的關系可能與利鈉肽有關。Asensio-López、Guo等報道發現，二甲雙胍和替米沙坦可通過調節脂聯素系統發揮心臟保護保護作用；我們結果顯示，相比于七氟醚預處理組，敲基因預處理組七氟醚心臟保護作用不明顯，心肌凋亡細胞數目，梗死面積以及心功能無差異。提示七氟醚預處理心臟保護作用可能與脂聯素相關。

我們的實驗結果顯示，七氟醚預處理減輕心肌細胞凋亡、減少梗死面積、改善MI/R后心臟功能，這一心臟保護作用在脂聯素敲除小鼠中大部分消失，提示七氟醚預處理的MI/R保護作用可能和增加血漿脂聯素濃度有關。這一發現有望為臨床使用七氟醚改善血管再通術后患者心功能提供理論依據。