YAP-c-Myc信號通路抑制涉及冬凌草甲素抗神經膠質瘤作用

王 宸，陳 爽，馬曉嬌，校 歡，邱紅梅

(重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

膠質瘤(glioma)是一種起始于大腦或脊柱神經膠質細胞的常見腫瘤，由于其發病位置的特殊性，具有較高的發病率和死亡率等特點[1]。膠質瘤通常采用的治療方法為手術切除、放療和化療，但盡管采取了這些干預措施，高級別腫瘤患者平均總生存期不到15個月，治療現狀與手術預后仍不樂觀[2]。中藥藥物治療具有巨大的應用前景，研究證明部分中藥單體成分對惡性腫瘤能產生一定的治療效果[3]，因此研究有效中藥單體成分是否具有抗膠質瘤作用可為其治療提供新的藥物治療思路。

冬凌草甲素(oridonin,ORI)是冬凌草的主要活性成分，是一種有生物活性的貝殼杉烷型四環二萜類天然有機化合物，具有抗感染、抗炎等作用，研究報道其還對多種癌癥具有抗癌活性[4]，被認為是一種有前景的腫瘤治療藥物。研究證明，ORI可通過誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯來抑制神經母細胞瘤細胞的生長[5]。目前，關于ORI抗腫瘤的分子機制研究逐漸進入研究者的視野，已有研究證明ORI可以通過調控AMPK/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin[6]、Bcl-2[7]等信號通路發揮抗惡性腫瘤作用。Yes相關蛋白(Yes associated protein，YAP)是Hippo通路中最核心的轉錄共激活因子，有研究發現其在膠質瘤中高表達,下調YAP可以抑制膠質瘤增殖、侵襲和遷移[8]，而ORI是否可以作用于YAP-Hippo通路而抑制膠質瘤尚未見報道。因此，本研究采用神經膠質瘤U87細胞研究ORI抗神經膠質瘤作用并探討其可能機制是否涉及抑制YAP-c-Myc信號通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 神經膠質瘤U87細胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。

1.1.2藥物與試劑 ORI(TargetMol，批號T2790-1，純度99.5%)；二甲基亞砜DMSO(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號99G001100)；DMEM培養基(重慶塞米克生物科技有限公司，批號20191907)；胎牛血清(重慶塞米克生物科技有限公司，批號20190602)；MTT(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號0326010160)；Annexin V /PI 凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號010220200713);alpha Tubulin兔多克隆抗體(Proteintech，批號00068510)；YAP 兔多克隆抗體(Proteintech，批號00076577)；p-YAP(Ser127) 兔多克隆抗體(Affinity，批號36z2539)；c-Myc 兔多克隆抗體(Proteintech，批號00081188)；caspase-3/P17/P19兔多克隆抗體(Proteintech，批號00081801);Bax兔多克隆抗體(Proteintech，批號00082363);Bcl-2兔多克隆抗體(Gene Tex，批號GT100064)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa，批號AIF2368A)；Bax、Bcl-2、caspase-3、YAP、c-Myc mRNA引物(TaKaRa，批號CIPX281)；SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號7E481B9)。

1.1.3儀器 細胞培養箱(Thermo)；細胞培養超凈臺(安泰技術有限公司)；倒置熒光顯微鏡(Nikon)；低溫離心機(Thermo)；濕式轉膜儀(Bio-Rad)；垂直電泳槽(Bio-Rad)；酶標儀(Thermo)；凝膠成像系統(Bio-Rad)；擴增儀(Bio-Rad S1000TMThermal Cycler)；定量PCR儀(Bio-Rad CFX ConnectTMReal Time System)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 神經膠質瘤U87細胞用含10% FBS的DMEM培養基培養(含100 kU·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素)。孵箱內條件為：恒溫37 ℃，CO2濃度為5%。全部實驗均采用對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2ORI的配制 取ORI干粉溶解于DMSO中，配制成濃度0.1 mol·L-1的藥物用0.22 μmol·L-1微孔濾膜過濾除菌后，避光儲存于-20 ℃低溫保存。

1.2.3MTT檢測細胞增殖情況 取對數生長期的U87細胞懸液(6×107·L-1)接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL(6×103個/孔)。置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中12 h后，換用含不同濃度ORI的DMEM培養基繼續培養，每個藥物濃度設置6個復孔。分別繼續培養24 h、48 h后，棄培養基，每孔加入20 μL MTT，置孵箱中孵育4 h后，加150 μL DMSO并劇烈震蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm波長處各孔的OD值。藥物對U87細胞生長的抑制率/%=[1-(實驗給藥組-空白組)/(陰性對照組-空白組)]×100%。

1.2.4劃痕試驗檢測細胞侵襲變化 消化對數生長期的U87細胞制成單細胞懸液，均勻接種于6孔板中，觀察細胞融合70%-80%時，使用無菌槍頭垂直于板面均勻豎直劃線，吸取舊培養液用PBS清洗2次。空白組加入無血清DMEM培養基，實驗組加入含不同濃度ORI的無血清DMEM培養基，對細胞進行拍照記錄此時狀態。放入細胞培養箱培養，于給藥12 h、24 h、36 h、48 h后拍照記錄劃痕修復情況，使用ImageJ計算細胞遷移率。細胞遷移率/%=[(剛劃痕后劃痕面積-培養不同時間點后劃痕面積)/剛劃痕后劃痕面積]×100%。

1.2.5流式細胞術檢測凋亡 取對數生長的神經膠質瘤U87細胞，接種于6孔板中，待細胞貼壁后，每孔分別加入2 mL用DMEM完全培養基稀釋的ORI(終濃度0、5、10 μmol·L-1)。藥物作用48 h后，收集細胞，使用Annexin V/PI雙重染色法檢測細胞凋亡情況。其中以0 μmol·L-1處理的U87細胞作為對照組。

1.2.6熒光實時定量PCR(qRT-PCR) 取對數生長期的神經膠質瘤U87細胞，接種于6孔板中，待細胞貼壁后，每孔分別加入2 mL用DMEM完全培養基稀釋的ORI(終濃度0、5、10 μmol·L-1)。藥物作用48 h后，使用TRIzol提取細胞總RNA，用Thermo微量核酸測定儀檢測RNA濃度后置于-80 ℃保存。用試劑盒逆轉錄RNA以合成cDNA，用SYBR qPCR Master Mix進行熒光定量PCR反應。實驗結果通過相對定量方法分析，計算2-ΔΔCt值，比較組間基因表達水平是否具有統計學意義。

Tab 1 Sequences of primers (5' to 3')

1.2.7Western blot 取對數生長期的神經膠質瘤U87細胞，接種于10 cm培養皿中，待其長到80%-90%左右，每瓶分別加入用DMEM完全培養基稀釋的ORI(終濃度0、5、10 μmol·L-1)7 mL。藥物作用48 h后，棄掉培養液，用PBS沖洗兩次并消化，加細胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶磷酸蛋白酶抑制劑=100 ∶1 ∶2)于冰上裂解15 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。取上清液用BCA法測定蛋白濃度后，加上樣緩存液煮沸變性10 min。蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，蛋白轉移至PVDF膜上，TBST洗膜3次，5% BSA室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，HRP標記山羊抗兔二抗(1 ∶7 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次每次10 min，加ECL發光試劑顯影，采用Image Lab 4.1進行圖像分析。以目的蛋白與α-Tubulin或GAPDH條帶灰度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 ORI對神經膠質瘤U87細胞增殖作用的影響ORI(結構式如Fig 1A)2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1和20 μmol·L-1處理U87細胞24 h和48 h 后，對細胞的增殖能力進行檢測，結果如Fig 1顯示，ORI濃度在10 μmol·L-1作用24 h、48 h對U87增殖均有明顯抑制作用(P<0.01)。利用SPSS 20.0計算ORI作用U87細胞24 h后IC50值為12.05 μmol·L-1，ORI作用U87細胞48 h后IC50值為10.17 μmol·L-1，根據上述結果，選用5 μmol·L-1和10 μmol·L-1的ORI處理U87細胞48 h作為實驗組，以0 μmol·L-1處理的U87細胞作為對照組。

Fig 1 Effects of ORI on survival rate of U87

2.2 ORI對神經膠質瘤U87細胞遷移作用的影響如Fig 2所示，ORI濃度在5 μmol·L-1、10 μmol·L-1時可明顯抑制U87細胞遷移。隨著ORI濃度的增高，U87細胞的遷移速度明顯下降，且作用時間越長，遷移速度下降越明顯(P<0.01)。

2.3 ORI對神經膠質瘤U87細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測細胞凋亡結果如Fig 3A、B所示，與對照組相比，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1的ORI處理組的總凋亡率明顯增加(P<0.01)。

2.4 ORI對神經膠質瘤U87細胞caspase-3、Bcl-2/Bax 的mRNA及蛋白表達的影響Western blot、qPCR結果如Fig 4所示，與對照組相比，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1的ORI處理組caspase-3 mRNA及蛋白表達均增加(P<0.05)，Bcl-2/Bax mRNA及蛋白表達均降低(P<0.05)。

Fig 2 Effects of ORI on migration rate of U87 in different

Fig 3 Effect of ORI on apoptosis of glioma U87

2.5 ORI對神經膠質瘤U87細胞YAP-c-Myc通路的影響如Fig 5所示，與對照組相比，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1的ORI處理組YAP、c-Myc mRNA及蛋白表達均降低(P<0.05)；磷酸化YAP蛋白表達增加(P<0.05)。

3 討論

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，WHO將膠質瘤分為I至IV級,其中高級別膠質瘤具有侵襲性更強，發展更為迅速，致死率高的特點，目前尚無確切可靠且不易復發的治療手段[9]。ORI作為唇形科冬凌草所提取的二萜類活性成分，可以對小細胞肺癌、胃癌等多種腫瘤產生抑制作用。研究顯示ORI可以使膠質瘤細胞周期停滯于S期，也可以誘導結腸癌細胞自噬產生凋亡[10]，但其是否可以通過YAP-Hippo通路抑制神經膠質瘤增殖并促進其凋亡尚未見報道。本研究采用神經膠質瘤U87細胞研究ORI的抗膠質瘤作用，并對其涉及的相關通路進行探索。

Hippo信號通路在調節細胞增殖和調控組織器官功能中起著至關重要的作用，可參與癌癥、心血管疾病等多種疾病的發生、發展[11]。高密度G蛋白偶聯受體被磷酸化的MST1/2刺激后可激活Hippo信號通路[12]。在Hippo信號通路中，磷酸化的MST1/2可將LATS1/2磷酸化，被磷酸化的LATS通過在14-3-3蛋白上形成結合位點來促進p-YAP (Ser127)、p-TAZ(Ser89)在胞質聚集，減少細胞核內轉錄發生[13]。YAP殘基S127磷酸化后的p-YAP (Ser127)不能進入細胞核內,因此研究YAP磷酸化的水平可以作為檢測Hippo通路活化狀態一種途徑。大量的臨床證據表明，YAP在多種類型的惡性腫瘤中均過表達或高度活化，明顯促進其增殖、遷移，減少凋亡，在治療人類癌癥中已經成為一種有吸引力潛在的藥物治療靶點[14]。c-Myc是YAP的轉錄靶標，YAP在進入細胞核后，YAP/TEAD復合物在細胞核內通過與c-Myc的啟動子和第一內含子相關聯而直接調節c-Myc的轉錄[15]。已有研究證實，c-Myc作為一個典型的促癌基因可參與調控細胞周期進程，與細胞生長、分化、代謝和凋亡有關，它的過表達與多種腫瘤的發生和轉移有密切關系[16]。但YAP-Hippo通路過度活化是否與神經膠質瘤發生具有相關性，且ORI是否具有可以通過干預該通路發揮抗膠質瘤作用尚未見報道。本研究結果顯示將ORI作用于U87細胞后，細胞生存率呈濃度依賴性降低，細胞遷移被抑制；流式細胞術顯示細胞凋亡率增加；caspase-3凋亡信號通路中caspase-3 mRNA和蛋白表達水平增加，Bcl-2/Bax mRNA及蛋白表達水平降低，提示ORI對U87細胞產生了促凋亡作用；

Fig 4 Effects of ORI on caspase-3,Bcl-2/Bax mRNA and protein expression of U87

Fig 5 Effects of ORI on YAP and c-Myc mRNA and protein expression of U87

Hippo信號通路中總YAP和下游c-Myc的 mRNA表達水平均降低，YAP、p-YAP(Ser127)、c-Myc蛋白檢測顯示，YAP總蛋白和c-Myc蛋白表達水平降低，YAP的S127位點磷酸化水平增高，提示ORI可能通過促進YAP蛋白磷酸化使其停留在胞質內與14-3-3結合形成復合物，發生泛素化使其水解，從而抑制其通路的活性，使進入細胞核的YAP減少，因此也減少了下游c-Myc的表達，提示ORI促神經膠質瘤U87細胞凋亡作用可能與抑制YAP-c-Myc信號通路有關。

綜上所述，本研究結果提示ORI對U87細胞有明顯抑制增殖和促進凋亡作用，其作用可能通過促進Hippo信號通路中的YAP磷酸化，使p-YAP(Ser127)聚集于細胞質，減少YAP進入細胞核內既而減少c-Myc的表達從而抑制YAP-c-Myc信號通路相關。本研究結果為ORI用于腫瘤相關疾病的治療提供了一定的實驗依據，為神經膠質瘤的治療提供了新的藥物治療思路。