基于p38MAPK/NF-κB信號通路的麻黃湯抗哮喘作用機制研究

萬浩宇，張 璐，萬海同，方馬一佳，潘璐佳，金偉鋒，何 昱

(浙江中醫藥大學 1.醫學技術學院、2.藥學院、3.生命科學院，浙江 杭州 310053)

隨著環境不斷惡化，空氣質量日益下降，全球哮喘的患病率和死亡率正逐年攀升[1]。氣道重塑作為哮喘的三大病理生理特征之一，是氣道炎癥慢性發展的必然結果。由于持續性的氣道炎癥反復發作，反復修復，導致組織增生而發生氣道重塑，最終導致氣道高反應性的發生[2]。相關研究表明，氣道重塑是導致哮喘難以根治的重要原因[3]。目前最有效的抗炎藥物糖皮質激素作為一線抗哮喘藥物，在臨床上被廣泛使用。但有研究表明，糖皮質激素對于抑制氣道重塑作用有較大的個體化差異，而且若長期應用也會出現代謝紊亂、抑制生長發育等不良反應[4]。因此，仍需不斷探尋新的抗哮喘藥物。近年來，越來越多的中藥已被證實能夠通過抑制哮喘相關的免疫反應和細胞因子來抑制哮喘氣道重塑，從而預防和治療哮喘[1]。

麻黃湯始載于張仲景的《傷寒論》，是臨床上辛溫解表的經典方劑。該方由麻黃、桂枝、苦杏仁、炙甘草四味藥材組成，具有發汗解表、止咳平喘的功效，可用于支氣管哮喘、流行性感冒等肺部疾病的治療[5]。但麻黃湯作為中藥復方，具有復雜的化學成分，其治療哮喘的作用機制也相對復雜，若僅僅只通過傳統的動物實驗或細胞實驗的方法研究其藥理機制則較為困難。而通過網絡藥理學可對麻黃湯治療哮喘的作用機制進行初步的篩選，使后續機制研究能更具有針對性。因此，本研究首先運用網絡藥理學的方法，篩選麻黃湯治療哮喘的潛在信號通路，并復制大鼠哮喘模型，探討麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑、氣道高反應的影響及其相關機制，以期為其臨床治療哮喘提供相應的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學數據庫中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP；生物分子功能注釋系統MAS3.0；臺灣中醫藥資料庫(TCM@Taiwan)；Cytoscape 3.6.0軟件；PharmGKB數據庫；Drugbank 數據庫；STITCH數據庫；OMIM 數據庫；TTD 數據庫。

1.2 動物健康雄性SD大鼠，體質量(230±20)g，浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供。動物許可證號:SCXK(浙)2014 -0001。

1.3 藥材、儀器與試劑麻黃(批號180801)、桂枝(批號180801)、炙甘草(批號180801)、苦杏仁(批號180910)均購自浙江中醫藥大學名中醫館。麻黃湯樣品為四味組方藥材加水煎煮后濃縮制得，每1 mL藥液相當于1 g生藥量，湯劑的密度值約為1.1 mg·L-1。

384酶標儀(美國MD公司)；EMKA動物肺功能檢測系統(北京廣源達科技發展有限公司)；402A1超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備有限公司)；高速冷凍離心機(Sigma公司)；可見紫外分光光度計(Beckman公司)；CFX384多重實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；MICROM HM340E石蠟切片機(德國MICROM公司)；OLYMPUS BX60型熒光顯微鏡攝像機(日本OLYMPUS公司)；Leica HI120型攤片機(德國Leica公司)。

地塞米松標準品(批號C10197719)、氫氧化鋁(批號C10206974)、氯化乙酰甲膽堿(Mch, 批號C10267781)均購自上海麥克林生化科技有限公司；卵清蛋白干粉(OVA，批號A5253)，購自美國Sigma公司；烏拉坦(批號Z23S8Y44213)，Rat VEGF、Rat bFGF、Rat TGF-β1、Rat OPN、Rat ET-1 ELISA 試劑盒(批號E20190101A)，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.4 信號通路篩選參照相關文獻[6-7]，利用TCMSP、TCM@Taiwan數據庫并結合文獻檢索結果收集麻黃湯中的化學成分；通過STITCH數據庫檢索成分對應靶點以及利用PharmGKB、Drugbank、OMIM 和TTD 數據庫檢索哮喘對應靶點，再通過Cytoscape軟件構建成分-靶點、麻黃湯靶點蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡、哮喘靶點PPI網絡及麻黃湯與哮喘靶點PPI網絡，合并相關PPI網絡后取其交集部分篩選麻黃湯治療哮喘的候選靶點，再通過GO分析以及KEGG通路分析篩選麻黃湯治療哮喘的潛在信號通路。

1.5 分組和給藥SD大鼠隨機分為6組，分別為空白對照組(N)、哮喘模型組(M)、麻黃湯高劑量組(10 mL·kg-1，MHT-H)、麻黃湯中劑量組(5 mL·kg-1，MHT-M)、麻黃湯低劑量組(2.5 mL·kg-1，MHT-L)、地塞米松組 (1 mg·kg-1，DXM)，每組6只大鼠。給藥組大鼠于首次致敏后d 15起灌胃相應藥物，每天1次，對照組及模型組大鼠每天灌胃生理鹽水，持續14 d。麻黃湯給藥劑量根據人臨床給藥劑量以及人和大鼠的體表面積換算而來。

1.6 大鼠哮喘模型的復制大鼠適應性喂養3 d后，除空白對照組外，其他各組大鼠參照文獻方法[8]，于d1及d8腹腔注射1 mL含10% OVA及10%氫氧化鋁的生理鹽水混懸液致敏，d15起將大鼠放入自制密閉容器內，超聲霧化吸入2% OVA混懸液，連續激發2周，每天1次，每次30 min。

1.7 哮喘大鼠氣道反應性檢測末次激發24 h后，大鼠放入體描箱中，使其穩定5 min以適應環境。首先測定各項Penh基礎值3 min，然后加入200 μL用生理鹽水稀釋的不同濃度Mch溶液，濃度由低到高依次為 0、3.125、6.25、12.5、25、50 g·L-1，每次霧化吸入時間2 min，每個激發劑量時的Penh值取霧化吸入后3 min的平均值。

1.8 大鼠血清相關指標檢測末次激發24 h后，大鼠按1.2 g·kg-1劑量用20%烏拉坦麻醉后，行腹主動脈采血。血樣3 000 r·min-1離心，取血清，分裝，凍存于-80 ℃冰箱備用。全部取樣結束后，ELISA測定大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1的含量。

1.9 PAS染色及MASSON染色腹主動脈取血后處死大鼠，取大鼠左肺，常規石蠟包埋，行PAS染色觀察大鼠氣道粘液分泌情況，行MASSON染色觀察大鼠氣道上皮下膠原沉積情況。

1.10 大鼠肺組織相關基因mRNA測定參考相關文獻[9]，TRIzol Reagent 法提取大鼠肺組織總RNA，將 RNA 反轉錄為 cDNA。用 Primer 5.0 軟件設計引物如Tab 1所示，PCR擴增體系及反應條件如Tab 2所示。擴增結束后，分析熔解曲線，鑒定PCR產物的特異性。獲取各個樣本量的Ct值，以GAPDH作對照，計算目的基因mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 網絡藥理學結果利用網絡藥理學共篩選出麻黃湯中58種化學成分，248個成分相關靶點，229個哮喘相關靶點，繪制麻黃湯成分-靶點、麻黃湯靶點PPI網絡、哮喘靶點PPI網絡及麻黃湯與哮喘靶點PPI網絡圖：麻黃湯成分-靶點網絡圖包括306個節點和359條邊；麻黃湯靶點PPI網絡共有6 093個相互作用蛋白，147 976條相互作用關系；哮喘靶點PPI網絡共有4 004個相互作用蛋白，91 454條相互作用關系；麻黃湯與哮喘靶點PPI網絡圖共有節點458個，相互作用關系912條。合并相交網絡篩選得出186個候選靶點。候選靶點進行GO分析和KEGG富集分析后，發現麻黃湯治療哮喘與蛋白質結合、轉錄因子活性、信號轉導、炎癥應答等過程關系密切，GO分析結果結果見Fig 1。KEGG通路注釋結果(Fig 2)則發現麻黃湯抗哮喘的作用機制可能涉及到Toll 樣受體、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、T 細胞受體等信號通路。

2.2 大鼠氣道性反應、氣道粘液分泌及氣道上皮下膠原沉積情況大鼠氣道性反應結果見Tab 3所示，與正常組大鼠相比較，當激發劑Mch濃度較高時，模型組大鼠Penh值均高于正常組大鼠(P<0.01)；各給藥組大鼠Penh值均低于模型組，當Mch激發濃度達到25、50 g·L-1時，麻黃湯各劑量組均能顯著降低哮喘大鼠Penh值(P<0.05)，表明麻黃湯能降低哮喘大鼠氣道反應性，改善哮喘氣道高反應。

Fig 1 Results of GO analysis

氣道粘液分泌及氣道上皮下膠原沉積情況見Fig 3A。PAS染色結果表明，正常組大鼠氣道上皮杯狀細胞數目較少，氣道粘液分泌較少；模型組大鼠氣道上皮杯狀細胞大量增生，管腔中粘液分泌較多，導致氣道狹窄；各給藥組與模型組相比，杯狀細胞數目及管腔內粘液分泌減少，表明麻黃湯能減少哮喘大鼠氣道上皮杯狀細胞數目，改善氣道粘液分泌情況。

MASSON染色結果(Fig 3B)表明，正常大鼠肺組織結構清楚，無明顯氣道上皮下膠原沉積情況；經OVA致敏激發后，大鼠氣道重塑現象嚴重，氣道管腔狹窄，且上皮下膠原過度沉積；給予不同藥物干預后，各給藥組大鼠上皮下膠原沉積情況均得到不同程度的改善，表明麻黃湯能有效改善哮喘大鼠氣道重塑情況。

Tab 1 PCR primers and conditions

Tab 2 Reaction system for PCR

Fig 2 Results of KEGG pathways analysis

Fig 3 PAS staining and Masson staining

GroupBaselineNS3.125 g·L-16.25 g·L-112.5 g·L-125 g·L-150 g·L-1N0.56±0.120.95±0.261.38±0.521.57±0.641.79±0.551.66±0.292.13±0.22M0.89±0.29?1.34±0.531.64±0.622.37±0.80?2.70±0.62?3.24±0.44??3.60±0.41??MHT-H0.69±0.171.32±0.251.39±0.391.83±0.561.96±0.622.12±0.93#2.32±0.99#MHT-M0.92±0.331.24±0.281.94±1.312.09±0.652.18±0.652.05±0.96#2.39±1.14#MHT-L0.76±0.181.18±0.361.47±0.382.27±0.792.30±0.842.04±0.65#2.47±0.67#DXM0.96±0.171.22±0.211.51±0.312.08±0.542.23±0.752.13±0.88#2.38±0.63#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.3 對哮喘大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1含量表達的影響如Fig 4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1的含量均上升(P<0.05)；與模型組比較，麻黃湯各劑量組均能降低大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1的含量(P<0.05)。

Fig 4 Effect of MHT on content of relatedfactors in serum of asthmatic

2.4 對哮喘大鼠肺組織中p38MAPK、NF-κB p65、VEGF mRNA表達的影響與對照組大鼠比較，模型組大鼠肺組織中p38MAPK、NF-κB p65、VEGF mRNA表達量增加(P<0.001)；麻黃湯組能下調大鼠肺組織中p38MAPK、NF-κB p65、VEGF的 mRNA表達量(P<0.01)，見Fig 5。

Fig 5 Changes of mRNA expression levelsof key genes in rat lung

3 討論

在本研究中，通過網絡藥理學共篩選出麻黃湯治療哮喘的186個候選靶點。GO富集分析顯示，信號轉導、炎癥應答、免疫響應等生物過程排名較靠前；在分子功能中，上述候選靶點主要涉及到蛋白質結合、轉錄因子活性等。炎癥介質在哮喘的慢性炎癥反應中有著重要的作用。課題組前期研究證實，麻黃湯可抑制哮喘大鼠炎癥因子的表達，改善其氣道炎癥[5]。而轉錄因子如活化蛋白-1則可以快速誘導并協同已存在的轉錄因子如GATA-3，激活Th2細胞內的IL-4、IL-5及IL-13的基因轉錄。Th2細胞分泌IL-4、IL-5等細胞因子并促進IgE大量合成，增強免疫應答。在KEGG生物途徑富集分析中，Toll 樣受體信號通路、MAPK信號通路、T 細胞受體信號通路等被顯著性富集，表明麻黃湯治療哮喘的機制可能與上述信號通路有關。

氣道高反應是哮喘的臨床癥狀之一，持續的氣道高反應會導致哮喘患者肺功能的下降，嚴重影響患者生活。本實驗中，OVA致敏激發4周后，隨著激發劑Mch濃度的升高，給藥組大鼠Penh值顯著降低，提示麻黃湯和地塞米松均能顯著改善哮喘大鼠氣道高反應，減輕哮喘癥狀。

ET-1作為哮喘中一種重要的致病因子，能促進氣道上皮細胞的生長，引發氣道平滑肌的強烈收縮，并刺激前列腺素、血栓素等炎癥介質的釋放，導致氣道反應性增高，同時加重機體缺氧、缺血，嚴重者甚至會造成哮喘性呼吸衰竭[10]。在本實驗中，各劑量麻黃湯均可下調哮喘大鼠血清中ET-1的含量，這與本實驗中氣道反應性結果趨勢一致，提示麻黃湯可能通過抑制ET-1分泌以調節哮喘氣道炎癥，改善氣道高反應。

哮喘氣道重塑的病理特征主要包括氣道平滑肌細胞的增殖遷移、氣道上皮下膠原沉積以及血管生成重塑等。本實驗中，OVA致敏激發后，大鼠氣道杯狀細胞大量增加，氣道粘液分泌增多，氣道上皮下膠原沉積明顯，經麻黃湯干預后，上述情況均得到不同程度的改善，這表明麻黃湯可減少哮喘大鼠肺組織病變，改善哮喘氣道重塑。

VEGF在哮喘發作時呈現高表達，可通過增加氣道的血管通透性以及血管平滑肌的增生，導致氣道黏膜增厚，加重氣道重塑。TGF-β1是氣道重塑過程中的一個關鍵因子，具有重要的促纖維化和免疫調節作用，可促進氣道平滑肌細胞肥大增生，氣道膠原的沉積以及結締組織蛋白的合成，導致不可逆的肺功能改變和氣道重塑的形成[11]。bFGF是廣泛分布于人體內的成纖維細胞生長因子的一個亞型，在平滑肌細胞的增殖、成肌纖維細胞表型的逆轉和氣道上皮細胞的遷移增殖中起重要作用[12]。本實驗結果顯示，OVA致敏后，大鼠血清中VEGF、TGF-β1、bFGF的表達顯著升高，而麻黃湯能顯著抑制三者的表達；RT-PCR檢測結果也證實，麻黃湯能顯著抑制哮喘大鼠肺組織中VEGF mRNA的表達。這說明麻黃湯可能是通過抑制VEGF、TGF-β1、bFGF的過度分泌以減輕哮喘大鼠氣道重塑癥狀。OPN是一類多功能細胞，在巨噬細胞、上皮細胞、嗜酸性粒細胞等多種哮喘關鍵細胞中均有相應受體表達。其可誘導VEGF的表達，促進新血管生成，同時增厚基底膜，加重哮喘氣道重塑[13]。本實驗證實不同劑量麻黃湯均可顯著降低哮喘大鼠血清中OPN的表達水平，說明麻黃湯改善氣道重塑可能與抑制OPN的表達相關。

p38MAPK信號途徑是MAPK家族的重要組成部分，在哮喘發生、發展的過程中發揮重要作用，在肺部疾病的研究中也較為成熟[14]。NF-κB 作為一種與炎癥反應密切相關的關鍵轉錄激活因子，是p38MAPK的下游通路。p38MAPK磷酸化后的特異性底物可激活NF-κB通路，并進一步激活轉錄VEGF的表達，調節新血管的發生和生長，加劇氣道重塑的進程。另有研究表明，TGF-β1可激活p38MAPK信號通路，調節一系列病理生理過程。而同時TGF-β1基因的轉錄又有賴于NF-κB的活化，進而使 TGF-β1 表達增加，加重氣道重塑[15]。本實驗PCR結果顯示，OVA致敏激發可使大鼠肺組織中p38MAPK以及NF-κB p65的mRNA表達水平較正常大鼠顯著升高，麻黃湯干預后，兩者的mRNA表達水平得到顯著抑制，同時NF-κB下游因子VEGF的mRNA表達水平也被顯著下調，提示麻黃湯可能通過調節p38MAPK/NF-κB信號通路上的關鍵基因來改善哮喘氣道重塑。

綜上所述，本研究證實麻黃湯可以改善哮喘大鼠的氣道重塑和氣道高反應，其機制可能與下調VEGF、bFGF、TGF-β1、ET-1、OPN含量以及p38MAPK/NF-κB信號通路上的關鍵基因p38MAPK、NF-κB p65 mRNA表達有關。