野菠蘿果中多糖、黃酮與多酚的含量測定 及抗氧化研究

◎ 成宏斌，李曉波，賈笑英，潘曉翠，王代軍，王帆林

（海南省農墾科學院，海南 ?？?571000）

研究表明，人體的細胞和組織在正常的氧化代謝過程中會產生自由基及活性氧等物質，正常情況下，自由基可促進膠原蛋白的合成、提高抗菌能力和調控基因的表達等。但是，當機體受到外界刺激，如環境污染、飲食過量和煙酒等因素影響時，易引起氧化應激反應，細胞及組織釋放大量的自由基，導致氧化損傷[1-2]，從而誘導心腦血管、癌癥、帕金森和腫瘤等疾病的發生[3-4]。因此，開發安全、有效的抗氧化劑就顯得尤為重要，目前市場的抗氧化劑以人工合成和天然產物提取為主，但人工合成的抗氧化劑有毒副作用、穩定性差和存在安全隱患，所以，來自植物安全無毒和穩定性強的天然抗氧化劑成為人們研究和開發的熱點[5]。

野菠蘿（Pandanus tectorius Sol.）也稱露兜樹、露兜簕和山菠蘿等，分布于東半球熱帶和亞熱帶地區，海南擁有較為豐富的露兜樹資源，但常作為綠化和觀賞的樹種。在民間可作為野果食用，同時也具有重要的藥用價值，有平肝清熱、去濕利尿的功效，可治療感冒發熱、肝火頭疼、痢疾等癥狀[6-7]。研究發現，野菠蘿果中含有多糖、黃酮、多酚和生物堿等多種天然活性成分，對其研究主要集中在降血糖、降血脂和降血壓等方面，但是關于野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚的抗氧化研究較少[8-11]。

本研究以野菠蘿果為原料，采用索式提取法提取黃酮、溶劑浸提法提取多糖和多酚3 種天然活性成分，并以DPPH 自由基清除能力和·OH 自由基清除能力為指標，進行多糖、多酚和黃酮的抗氧化活性檢測及比較研究，以期為野菠蘿果的綜合利用提供理論依據，促進相關抗氧化功效食品的研發。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野菠蘿果實，產于海南省?？谑型筒h。

蘆丁標準品（純度≥98%）、沒食子酸標準品（純度≥98%）、D（+）-無水葡萄糖標準品（純度≥98%），均為分析純，購自上海源葉生物科技有限公司；L（+）-抗壞血酸、六水合三氯化鐵、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、30%過氧化氫和二水合草酸，均為分析純，購自西隴科學股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、硫酸亞鐵七水合物、水楊酸和福林酚，均為分析純，購自上海源葉生物科技有限公司；苯酚，分析純，購自廣州化學試劑廠；無水乙醇，分析純，購自廣東光華科技股份有限公司；碳酸鈉，分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-7502PC 紫外分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；KE52AA 旋轉蒸發器、SHI-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；SXT-06 型索式提取器，上海洪紀儀器設備有限公司；20B 風冷式萬能粉碎機，河南晟峰瑞樺機械設備有限公司；ME2002E 電子分析天平、ME204E 精密電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101T 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州予華儀器制造有限公司。

1.3 野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的提取

1.3.1 黃酮的提取

采用索式提取法提取野菠蘿果中的黃酮。精密稱取野菠蘿果粉末4.000 g，以80%乙醇為溶媒，固液比為1 ∶25，提取溫度為90 ℃，提取4 h，最后將提取液定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，即得[12-13]。

1.3.2 多糖的提取

采用溶劑浸提法提取野菠蘿果中的多糖。精密稱取野菠蘿果粉末5.000 g 并置于250 mL 的三角瓶中，以200 mL 的蒸餾水為溶劑，80 ℃水浴浸提2 h，抽濾得澄清液，50 ℃真空旋蒸濃縮后定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，即得[14-15]。

1.3.3 多酚的提取

采用溶劑浸提法提取野菠蘿果中的多酚。精密稱取野菠蘿果粉末2.500 g 并置于250 mL 的三角瓶中，量取100 mL 60%乙醇溶液，60 ℃水浴攪拌2 h，抽濾得上清液并定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，即得[16]。

1.4 野菠蘿果中黃酮含量的測定

1.4.1 蘆丁標準曲線的繪制

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法繪制黃酮的標準曲線[17]，精密稱取蘆丁10.8 mg 用80%乙醇溶解并定容至50.0 mL，其終濃度為0.216 mg·mL-1，冷藏備用。分別精取標準液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL和1.8 mL 于10.0 mL 的容量瓶，依次加入80%的乙醇至2.0 mL，再加入0.4 mL 質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液和0.4 mL 質量分數為10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置10 min，再加入4.0 mL 質量分數為10%的氫氧化鈉溶液，最后加80%的乙醇定容至10.0 mL。用無水乙醇做空白對照，于510 nm 處測定吸光度，用最小二乘法進行線性擬合，得出回歸方程及相關系數R2。

1.4.2 黃酮含量的測定

準確量取野菠蘿果黃酮提取液2 mL，參照1.3.1蘆丁標準曲線繪制方法處理，測得吸光值并帶入回歸方程，求出野菠蘿果中黃酮的含量。

1.5 野菠蘿果中多糖含量的測定

1.5.1 葡萄糖標準曲線的繪制

采用苯酚硫酸法繪制多糖的標準曲線[18]，精密稱取葡萄糖粉末11.0 mg 置于棕色的容量瓶中，加蒸餾水定容至100 mL，其終濃度為0.11 mg·mL-1。分別量取標準液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL和0.7 mL 于10 mL 的棕色容量瓶中，依次加入蒸餾水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液2 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸7.0 mL，迅速搖勻，放置10 min，沸水浴加熱20 min，放于陰涼處至室溫，用蒸餾水做空白對照，于488 nm 處測定吸光度，以多糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸，得出回歸方程及相關系數R2。

1.5.2 多糖含量的測定

準確量取野菠蘿果多糖提取液1 mL，參照1.4.1葡萄糖標準曲線繪制方法處理，測得吸光值并帶入回歸方程，求出野菠蘿果中多糖的含量。

1.6 野菠蘿果中多酚含量的測定

1.6.1 沒食子酸標準曲線的繪制

采用福林-酚比色法繪制多酚的標準曲線[19]，精確稱量沒食子酸標準品10.0 mg，去離子水超聲溶解并定容至100 mL，其終濃度為0.1 mg·mL-1，冷藏備用。分別移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL沒食子酸溶液，去離子水補充至1 mL，分別加入1 N福林酚試劑1 mL，室溫反應3 min，在分別加入10%碳酸鈉溶液1.0 mL，30 ℃條件下反應30 min，于760 nm處測定吸光度，用最小二乘法進行線性擬合，得出回歸方程及相關系數R2。

1.6.2 多酚含量的測定

準確量取野菠蘿果多酚提取液1 mL，參照1.5.1沒食子酸標準曲線繪制方法處理，測得吸光值并帶入回歸方程，求出野菠蘿果中多酚的含量。

1.7 抗氧化實驗

1.7.1 DPPH 自由基清除率的測定

參照GONG Jinyan 等的方法[20]，將野菠蘿果供試液（黃酮、多糖和多酚）配制成不同濃度的樣品溶液（0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1），精密移取2 mL 于試管中，加入0.25 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液2 mL，混勻。室溫靜置30 min，于517 nm 波長處測量吸光度，記為A1，2 mL 樣品溶液與2 mL 無水乙醇混合均勻，測量吸光度，記為A2，2 mL DPPH 乙醇溶液與2 mL 無水乙醇溶液混合均勻，測量吸光度，記為A3，用維生素C（Vc）作為陽性對照，設3 個平行試驗，按式（1）計算DPPH 清除率，取均值±標準方差。

1.7.2 ·OH 自由基清除能力的測定

參照CHEN Ling 等的方法并稍作修改[21]，取2.0 mL 不同濃度的野菠蘿果供試液（0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1）加入到比色管中，再依次分別加入2.0 mL 濃 度 為8.0 mmol·L-1的FeSO4溶 液，2.0 mL濃 度 為8.0 mmol·L-1的H2O2溶 液 和2.0 mL 濃 度 為8.0 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液混合均勻，避光在37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫后離心，最后在510 nm測上清液的吸光值，記為Ai，用無水乙醇替換水楊酸-乙醇溶液測定其吸光值為Aj，用蒸餾水替換檢測液測定其吸光值為A0。以Vc 作為陽性對照，設3 個平行試驗，按式（2）計算·OH 自由基清除率，取均值±標準方差。

1.8 數據處理

采用SPSS20.0 和Origin8.0 進行數據處理、繪圖及分析，每個試驗均在相同水平條件下進行3 次。

2 結果與分析

2.1 野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的含量測定

按照1.3、1.4 和1.5 方法所述標準曲線的繪制，根據硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法、苯酚硫酸法和福林-酚比色法分別測定了野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚含量的標準曲線，如圖1 ～圖3 所示。

從上述結果分析得出，黃酮、多糖和多酚的標準曲線線性擬合效果較佳，相關系數R2均大于0.990。因此，從上述方法得出野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的含量分別為2.30 mg·g-1、4.32 mg·g-1和1.28 mg·g-1。

圖1 黃酮的標準曲線圖

圖2 多糖的標準曲線圖

圖3 多酚的標準曲線圖

2.2 野菠蘿果中黃酮多糖和多酚的抗氧化研究結果

Andriani 等學者發現，野菠蘿果不同溶劑的提取物均具有較好的抗氧化能力，但是關于野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的抗氧化功能及綜合對比的研究還未見報道[22]。因此，本研究以DPPH 自由基清除能力和·OH 自由基清除能力為參考指標對野菠蘿3 種活性物質進行抗氧化活性檢測。

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基是一種人工合成、比較穩定的非生理自由基，在乙醇溶液中呈紫紅色，當向DPPH 自由基溶液中加入抗氧化物質時，紫紅色的DPPH 自由基溶液被還原成黃色，其DPPH 清除率越大，表明抗氧化能力越強，經常用于評價化學物質或食品的抗氧化能力[23-25]。本研究以Vc 作陽性對照，對野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚3 種活性物質對DPPH 清除能力進行綜合測定并比較，試驗結果如圖4 所示。

圖4 三種活性物質對DPPH 清除能力圖

從圖4 可以看出，野菠蘿果中黃酮、多糖、多酚和Vc 均對DPPH 有顯著的清除能力，且存在著量效關系，隨著濃度的逐漸增加，DPPH 清除能力顯著提高。當濃度達到0.02 mg·mL-1時，黃酮、多糖、多酚和Vc 對DPPH 清除率逐漸開始趨于平緩，同時發現，在相同濃度下，可以看出Vc 清除率高于黃酮、多糖和多酚，且在同一濃度下多糖的清除率顯著高于黃酮和多酚的清除率，初步說明野菠蘿果中多糖具有較強的抗氧化能力，黃酮和多酚具有較好的抗氧化能力。其中野菠蘿果多糖的DPPH 自由基清除率的IC50為（0.010±0.288）mg·mL-1，黃酮的DPPH 自由基清除率的IC50為（0.017±0.283）mg·mL-1，多酚的DPPH自由基清除率的IC50為（0.025±0.266）mg·mL-1，進一步說明野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚有著較好的DPPH 清除能力且多糖的清除效果最佳。

2.2.2 ·OH 自由基清除能力

·OH 自由基具有很強的抗氧化能力且十分活躍，能與大多數物質發生氧化反應導致細胞失活或壞死，抗氧化劑能夠有效的清除·OH 自由基的產生量，從而抑制氧化的發生[26-27]。本試驗測定了野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚3 種活性物質對·OH 自由基的清除能力并進行相互比較，以Vc 作陽性對照，其結果如圖5 所示。

圖5 3 種活性物質對·OH 自由基清除能力圖

從圖5 結果表明，在試驗濃度范圍內，3 種活性物質對·OH 自由基清除能力隨著濃度的增大逐漸增加，Vc 的·OH 自由基清除率高于多糖的清除率、顯著高于黃酮和多酚的清除率。同時，在相同濃度下，黃酮和多酚的清除率效果相差不大，而多糖的清除率顯著高于黃酮和多酚的·OH 自由基清除率，說明野菠蘿果中多糖具有較強的抗氧化能力，黃酮和多酚具有較好的抗氧化能力。當濃度達到0.1 mg·mL-1，3 種活性物質的清除率均達到最大值，多糖對·OH 自由基清除 率 達 到65.15%，IC50為（0.041±0.229）mg·mL-1，黃 酮 對·OH 自 由 基 清 除 率 達 到21.21%，IC50為（0.400±0.032）mg·mL-1，多酚對·OH 自由基清除率達 到20.23%，IC50為（0.382±0.039）mg·mL-1。由此可見，多糖對·OH 自由基的清除效果高于多酚和黃酮的清除效果，具很強的抗氧化能力。

3 結論

本研究對野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚進行提取并檢測其含量，同時用兩種方法測定野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚的抗氧化活性并進行比較研究。結果表明，野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚均有著較好的抗氧化活性，且多糖的抗氧化活性較高于黃酮和多酚的抗氧化活性。野菠蘿果中多糖清除DPPH 的IC50為（0.010±0.288）mg·mL-1、清 除·OH 的IC50為（0.041±0.229）mg·mL-1，多糖的抗氧化性較高于黃酮和多酚的抗氧化性。綜上所述，野菠蘿果可作為一種安全、綠色的天然抗氧化物的來源，在食品、化妝品和醫藥等方面具有較高的應用價值和較好的市場前景。