探究PCR 技術在食品微生物檢測中的應用

◎ 張麗敏，劉印歡，左麗娜，高 騰

（石家莊君樂寶乳業有限公司，河北 石家莊 050000）

1 食品微生物檢測現狀

有害微生物是導致食品風險的主要因素。微生物的種類有非常多，并且存在超強的變異性，微生物檢測手段也一直在進步。隨著近幾年分子生物學的快速發展，具備超強特異性、靈敏度等優點的聚合酶鏈式反應（PCR 技術），已經成為食品有害微生物檢測的一種常規方法。目前，很多生物制品公司利用傳統的微生物檢測原理設計了不同的檢測儀器，同時，微生物檢測應當向著快速、自動化方向發展，PCR 已經作為一種新的檢測方法在一些行業和地區得到了應用。與傳統的檢測方法相比，PCR 技術檢驗速度快、特異性強、靈敏度高，可以減少對微生物培養的依賴，因此也逐漸成為食品檢驗中的常用方法。

2 PCR 技術

PCR 技術，全稱聚合酶鏈式反應，是通過對溫度的控制，從而在體外擴增出大量靶DNA 片段，該技術可將靶DNA 片段在短時間內擴增到十萬甚至是百萬倍。PCR 技術具備超強的特異性，它的原理是和DNA 的自然復制過程類似。通過溫度的變化控制DNA 的變性、復性，完成DNA 體外復制。PCR 體外復制過程主要包含以下3 個步驟，①變性。溫度在一定時間內保持在94 ℃左右，雙鏈DNA 會解離成單鏈。②復性。將溫度降低，保持在55 ℃左右，引物與單鏈DNA 結合。③延伸。通過TaqDNA 聚合酶的作用，將dNTP 作為反應原材料，合成和模板DNA 互補的一條新鏈。然后重復循環以上步驟，1 h 內即可完成大量DNA 的合成。一般情況下，PCR 技術的檢驗速度比傳統模式更有優勢。

3 應用PCR 進行檢測的微生物菌種類型

3.1 沙門氏菌

沙門氏菌是一類主要寄生在人和動物腸道中的微生物，屬于革蘭氏陰性桿菌，其生化反應和人體的抗原結構有關。受污染的水是沙門氏菌感染的主要來源。沙門氏菌會導致人類和動物疾病，人類疾病的主要包括傷寒和敗血癥。沙門氏菌SP-1 的毒性很低，但是在菌體裂解過程中產生的強毒性的內毒素，會迅速侵入宿主細胞，從而危害人體健康。目前，invA、invb、hila、FIMA、16S rRNA 是沙門氏菌檢測的主要靶基因。

3.2 單核增生李斯特菌

單核細胞增生李斯特菌生長的溫度范圍為2～42 ℃，主要存在于污水和腐爛蔬菜中。它很容易通過食品和糞便傳播。這種微生物是一種細胞內寄生細菌。單核細胞增生性李斯特菌感染早期常表現為非典型感冒樣癥狀，臨床表現為敗血癥、腦炎等，也可能導致流產。單核細胞增生李斯特菌的毒力基因主要包括LIPI-1 和UPI-2，最常用的檢測基因是hly-A、inl-A 和ACT-A。

3.3 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是嗜鹽菌，3.5%的NaCl 最合適微生物生長。副溶血性弧菌致病性的關鍵在于它與宿主細胞會產生相互作用。例如，TDH 的微生物可以使人或兔子的紅細胞產生神奈川現象。但是這些基因在環境中很少被檢測到。

3.4 阪崎氏腸桿菌

阪崎腸桿菌培養要求低，不形成孢子。這種微生物和單核增生李斯特菌相類似，其主要危害是引發人體腦膜炎和敗血癥。這兩種病癥的易感人群為早產兒和低出生體重兒這類抵抗力很弱的新生兒群體，因此其對新生兒的健康威脅還是很大的。阪崎腸桿菌感染不常發生，但嬰兒感染所帶來的風險是致命的，主要是附著在腸道組織上，通過血腦屏障導致嬰兒腦細胞死亡。阪崎腸桿菌的分子檢測主要是用ITS 基因和16S rRNA 兩種基因進行測定。

3.5 金黃色葡萄球菌

目前沒有針對金黃色葡萄球菌的疫苗。金黃色葡萄球菌營養要求不高，空氣、水、灰塵和人畜排泄物都中可能存在。臨床上重要的毒力基因包括luks/f-pv基因和TST 基因。

4 PCR 檢測中的微生物采樣

微生物采樣需要做好有效的執行方法，確定了采樣方案之后，采樣方法的有效執行和樣品的有效性在一定程度上與最后的檢驗結果有關。

4.1 現場采樣注意事項

現場采樣過程需要規范操作，所有的采樣工具都應該是經過高壓滅菌的，以避免一切污染，容器需要干燥清潔、大小合適，采樣過程中，應采取必要的措施防止食品中固有微生物的數量和生長能力發生變化，確保檢樣的代表性。若取樣的是固體食品，也需要根據相關的管理辦法，不破壞產品的代表性。若取樣的是液體，應當在取樣之前搖晃或者攪拌，將其混合均勻，通常情況下需要將樣品冷卻到0 ～4 ℃，再進行檢驗。

4.2 生產過程取樣注意事項

生產過程中的取樣中，應當注意其隨機性和無菌性，以車間的用水取樣為例，要從各個水龍頭上取樣，若進行車間衛生監測，應當在保證水龍頭表面干燥的基礎上，用無菌稀釋液潤濕棉簽擦拭龍頭表面，若檢測空氣狀況，則在車間的四角和中部分別放置平皿蓋，暴露采樣檢驗。

5 PCR 技術在食品微生物檢驗中的應用

以牛奶樣品的基因組提取與檢驗分析為例進行分析，操作步驟應當符合《分子克隆實驗指南》。

5.1 DNA 提取

脂肪的密度較小，自然情況下會出現輕微的上浮，為了提升檢驗效率，一般會采用高速離心的方式實現脫脂。取乳品樣品10 mL，將樣品放置到LB 液體培養基中，充分混合，使用機器高速離心，時間設置為5 min，然后去除上層的脂肪。然后放入115 ℃的環境中高溫滅菌，將微生物全部殺死，避免出現分裂影響實驗結果的問題。在制備的樣品中加入2 μL 蛋白酶，去除蛋白質，取10 μL 0.5 mol·L-1的EDTANa2溶液加入樣品中，以上流程完成之后，應離心2 min 最后用滅菌生理鹽水清洗。

5.2 測序

對分離株和產物的序列結果進行分析，以Gen Bank 公布的序列結果進行比照，分析其微生物的保守區序列和測序結果是否一致。

5.3 PCR 檢測效果

用相同的引物和反應條件在無乳鏈球菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌等DNA 中擴增，如果得不到已知的DNA 擴增片段，則證明了PCR 檢驗的單一性。牛奶樣品的宏基因組的測定，主要進行普通PCR 和qPCR 兩項檢測。以沙門氏菌為例，如果未添加細菌的牛奶加標樣品在連續梯度稀釋下產生明顯的擴增曲線，最后將樣品放置在置有緩沖蛋白胨水中，在37 ℃的環境下培養，培養結果表明，部分沙門氏菌污染樣品能被有效檢測。

6 食品微生物檢測結果判定標準

經PCR 檢測得出單位食品樣品中的微生物含量情況后，需要分析檢測結果數據，并判定食品樣品是否合格，判斷方法主要有以下2 種。

6.1 二級法

二級法是根據樣品數量（n）、不合格品儲糧（c）、國家規定的合格判定標準（m）進行判斷，超過m值即為不合格品。例如生海產品，n=5，c=0，m=102，n=5，即取5 個樣品，c=0 表示該批樣品中未發現超過m值的樣品，則說明該產品合格。

6.2 三級法

二級法是根據樣品數量（n）、不合格品儲糧（c）、國家規定的合格判定標準（m）與判定為合格的菌數限量（M）進行判斷，m、M這兩個量是相互關聯的，如果m不符合標準則直接不合格，如果m符合標準但是M不符合標準，則也是不合格。這一標準更加嚴格，以某批產品為例，n=5，c=3，m=101，M=102，這其中可以有小于等于3 個樣品的菌種數量在m～M，如果有3 個以上的菌種在m～M，或者其中有任何一個超過M值，就說明這批產品不合格。

7 結語

總而言之，隨著時代的發展，食品安全問題應當得到有效解決，高效精準的食品檢驗技術在當下具有很強的研究意義，而保證食品中微生物的檢驗的科學性、安全性，具有深刻的研究價值，為了達到提升食品安全質量標準的目的，應當做好微生物檢測的深度研究，保證食品檢驗工作質量，保障大眾的身體健康。