探究PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

◎ 張麗敏，劉印歡，左麗娜，高 騰

（石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050000）

1 食品微生物檢測現(xiàn)狀

有害微生物是導(dǎo)致食品風(fēng)險(xiǎn)的主要因素。微生物的種類有非常多，并且存在超強(qiáng)的變異性，微生物檢測手段也一直在進(jìn)步。隨著近幾年分子生物學(xué)的快速發(fā)展，具備超強(qiáng)特異性、靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR 技術(shù)），已經(jīng)成為食品有害微生物檢測的一種常規(guī)方法。目前，很多生物制品公司利用傳統(tǒng)的微生物檢測原理設(shè)計(jì)了不同的檢測儀器，同時(shí)，微生物檢測應(yīng)當(dāng)向著快速、自動化方向發(fā)展，PCR 已經(jīng)作為一種新的檢測方法在一些行業(yè)和地區(qū)得到了應(yīng)用。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，PCR 技術(shù)檢驗(yàn)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以減少對微生物培養(yǎng)的依賴，因此也逐漸成為食品檢驗(yàn)中的常用方法。

2 PCR 技術(shù)

PCR 技術(shù)，全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是通過對溫度的控制，從而在體外擴(kuò)增出大量靶DNA 片段，該技術(shù)可將靶DNA 片段在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增到十萬甚至是百萬倍。PCR 技術(shù)具備超強(qiáng)的特異性，它的原理是和DNA 的自然復(fù)制過程類似。通過溫度的變化控制DNA 的變性、復(fù)性，完成DNA 體外復(fù)制。PCR 體外復(fù)制過程主要包含以下3 個(gè)步驟，①變性。溫度在一定時(shí)間內(nèi)保持在94 ℃左右，雙鏈DNA 會解離成單鏈。②復(fù)性。將溫度降低，保持在55 ℃左右，引物與單鏈DNA 結(jié)合。③延伸。通過TaqDNA 聚合酶的作用，將dNTP 作為反應(yīng)原材料，合成和模板DNA 互補(bǔ)的一條新鏈。然后重復(fù)循環(huán)以上步驟，1 h 內(nèi)即可完成大量DNA 的合成。一般情況下，PCR 技術(shù)的檢驗(yàn)速度比傳統(tǒng)模式更有優(yōu)勢。

3 應(yīng)用PCR 進(jìn)行檢測的微生物菌種類型

3.1 沙門氏菌

沙門氏菌是一類主要寄生在人和動物腸道中的微生物，屬于革蘭氏陰性桿菌，其生化反應(yīng)和人體的抗原結(jié)構(gòu)有關(guān)。受污染的水是沙門氏菌感染的主要來源。沙門氏菌會導(dǎo)致人類和動物疾病，人類疾病的主要包括傷寒和敗血癥。沙門氏菌SP-1 的毒性很低，但是在菌體裂解過程中產(chǎn)生的強(qiáng)毒性的內(nèi)毒素，會迅速侵入宿主細(xì)胞，從而危害人體健康。目前，invA、invb、hila、FIMA、16S rRNA 是沙門氏菌檢測的主要靶基因。

3.2 單核增生李斯特菌

單核細(xì)胞增生李斯特菌生長的溫度范圍為2～42 ℃，主要存在于污水和腐爛蔬菜中。它很容易通過食品和糞便傳播。這種微生物是一種細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌。單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染早期常表現(xiàn)為非典型感冒樣癥狀，臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦炎等，也可能導(dǎo)致流產(chǎn)。單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒力基因主要包括LIPI-1 和UPI-2，最常用的檢測基因是hly-A、inl-A 和ACT-A。

3.3 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是嗜鹽菌，3.5%的NaCl 最合適微生物生長。副溶血性弧菌致病性的關(guān)鍵在于它與宿主細(xì)胞會產(chǎn)生相互作用。例如，TDH 的微生物可以使人或兔子的紅細(xì)胞產(chǎn)生神奈川現(xiàn)象。但是這些基因在環(huán)境中很少被檢測到。

3.4 阪崎氏腸桿菌

阪崎腸桿菌培養(yǎng)要求低，不形成孢子。這種微生物和單核增生李斯特菌相類似，其主要危害是引發(fā)人體腦膜炎和敗血癥。這兩種病癥的易感人群為早產(chǎn)兒和低出生體重兒這類抵抗力很弱的新生兒群體，因此其對新生兒的健康威脅還是很大的。阪崎腸桿菌感染不常發(fā)生，但嬰兒感染所帶來的風(fēng)險(xiǎn)是致命的，主要是附著在腸道組織上，通過血腦屏障導(dǎo)致嬰兒腦細(xì)胞死亡。阪崎腸桿菌的分子檢測主要是用ITS 基因和16S rRNA 兩種基因進(jìn)行測定。

3.5 金黃色葡萄球菌

目前沒有針對金黃色葡萄球菌的疫苗。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，空氣、水、灰塵和人畜排泄物都中可能存在。臨床上重要的毒力基因包括luks/f-pv基因和TST 基因。

4 PCR 檢測中的微生物采樣

微生物采樣需要做好有效的執(zhí)行方法，確定了采樣方案之后，采樣方法的有效執(zhí)行和樣品的有效性在一定程度上與最后的檢驗(yàn)結(jié)果有關(guān)。

4.1 現(xiàn)場采樣注意事項(xiàng)

現(xiàn)場采樣過程需要規(guī)范操作，所有的采樣工具都應(yīng)該是經(jīng)過高壓滅菌的，以避免一切污染，容器需要干燥清潔、大小合適，采樣過程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化，確保檢樣的代表性。若取樣的是固體食品，也需要根據(jù)相關(guān)的管理辦法，不破壞產(chǎn)品的代表性。若取樣的是液體，應(yīng)當(dāng)在取樣之前搖晃或者攪拌，將其混合均勻，通常情況下需要將樣品冷卻到0 ～4 ℃，再進(jìn)行檢驗(yàn)。

4.2 生產(chǎn)過程取樣注意事項(xiàng)

生產(chǎn)過程中的取樣中，應(yīng)當(dāng)注意其隨機(jī)性和無菌性，以車間的用水取樣為例，要從各個(gè)水龍頭上取樣，若進(jìn)行車間衛(wèi)生監(jiān)測，應(yīng)當(dāng)在保證水龍頭表面干燥的基礎(chǔ)上，用無菌稀釋液潤濕棉簽擦拭龍頭表面，若檢測空氣狀況，則在車間的四角和中部分別放置平皿蓋，暴露采樣檢驗(yàn)。

5 PCR 技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

以牛奶樣品的基因組提取與檢驗(yàn)分析為例進(jìn)行分析，操作步驟應(yīng)當(dāng)符合《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

5.1 DNA 提取

脂肪的密度較小，自然情況下會出現(xiàn)輕微的上浮，為了提升檢驗(yàn)效率，一般會采用高速離心的方式實(shí)現(xiàn)脫脂。取乳品樣品10 mL，將樣品放置到LB 液體培養(yǎng)基中，充分混合，使用機(jī)器高速離心，時(shí)間設(shè)置為5 min，然后去除上層的脂肪。然后放入115 ℃的環(huán)境中高溫滅菌，將微生物全部殺死，避免出現(xiàn)分裂影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問題。在制備的樣品中加入2 μL 蛋白酶，去除蛋白質(zhì)，取10 μL 0.5 mol·L-1的EDTANa2溶液加入樣品中，以上流程完成之后，應(yīng)離心2 min 最后用滅菌生理鹽水清洗。

5.2 測序

對分離株和產(chǎn)物的序列結(jié)果進(jìn)行分析，以Gen Bank 公布的序列結(jié)果進(jìn)行比照，分析其微生物的保守區(qū)序列和測序結(jié)果是否一致。

5.3 PCR 檢測效果

用相同的引物和反應(yīng)條件在無乳鏈球菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌等DNA 中擴(kuò)增，如果得不到已知的DNA 擴(kuò)增片段，則證明了PCR 檢驗(yàn)的單一性。牛奶樣品的宏基因組的測定，主要進(jìn)行普通PCR 和qPCR 兩項(xiàng)檢測。以沙門氏菌為例，如果未添加細(xì)菌的牛奶加標(biāo)樣品在連續(xù)梯度稀釋下產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增曲線，最后將樣品放置在置有緩沖蛋白胨水中，在37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果表明，部分沙門氏菌污染樣品能被有效檢測。

6 食品微生物檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)PCR 檢測得出單位食品樣品中的微生物含量情況后，需要分析檢測結(jié)果數(shù)據(jù)，并判定食品樣品是否合格，判斷方法主要有以下2 種。

6.1 二級法

二級法是根據(jù)樣品數(shù)量（n）、不合格品儲糧（c）、國家規(guī)定的合格判定標(biāo)準(zhǔn)（m）進(jìn)行判斷，超過m值即為不合格品。例如生海產(chǎn)品，n=5，c=0，m=102，n=5，即取5 個(gè)樣品，c=0 表示該批樣品中未發(fā)現(xiàn)超過m值的樣品，則說明該產(chǎn)品合格。

6.2 三級法

二級法是根據(jù)樣品數(shù)量（n）、不合格品儲糧（c）、國家規(guī)定的合格判定標(biāo)準(zhǔn)（m）與判定為合格的菌數(shù)限量（M）進(jìn)行判斷，m、M這兩個(gè)量是相互關(guān)聯(lián)的，如果m不符合標(biāo)準(zhǔn)則直接不合格，如果m符合標(biāo)準(zhǔn)但是M不符合標(biāo)準(zhǔn)，則也是不合格。這一標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格，以某批產(chǎn)品為例，n=5，c=3，m=101，M=102，這其中可以有小于等于3 個(gè)樣品的菌種數(shù)量在m～M，如果有3 個(gè)以上的菌種在m～M，或者其中有任何一個(gè)超過M值，就說明這批產(chǎn)品不合格。

7 結(jié)語

總而言之，隨著時(shí)代的發(fā)展，食品安全問題應(yīng)當(dāng)?shù)玫接行Ы鉀Q，高效精準(zhǔn)的食品檢驗(yàn)技術(shù)在當(dāng)下具有很強(qiáng)的研究意義，而保證食品中微生物的檢驗(yàn)的科學(xué)性、安全性，具有深刻的研究價(jià)值，為了達(dá)到提升食品安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的目的，應(yīng)當(dāng)做好微生物檢測的深度研究，保證食品檢驗(yàn)工作質(zhì)量，保障大眾的身體健康。