超高效液相串聯質譜檢測玉米中 5 種真菌毒素的方法研究

◎ 郝國輝

（江蘇省農產品質量檢驗測試中心，江蘇 南京 210036）

糧食在種植、收獲、加工、運輸和儲存過程中易被真菌感染而產生真菌毒素，這些真菌毒素隨著糧食及其制品進入食物鏈，最終可能引起人或動物的致癌、致畸等病變[1]。我國玉米由于后期處理及儲存條件的原因，真菌毒素的污染較為嚴重[2]。黃曲霉毒素B1（AFB1）是迄今發現的毒性最強的真菌毒素；伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌屬真菌產生的一類強毒和致癌性真菌毒素，其中伏馬毒素B1（FB1）是代表性成分之一；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又名嘔吐毒素，目前對糧食污染最為普遍[3]；玉米赤霉烯酮（ZEN）化學性質穩定，高溫下難分解，嚴重威脅肉類生產的安全和人類健康[4]。玉米中DON 和AFB1容易動態積累，AFB1受生育期影響較大；ZEN 含量變化比較平穩[5]。鑒于QuECHERS 技術與超高效液相串聯質譜（UPLC-MS/MS）相結合的優勢[6-8]，為了同時檢測玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素B1（AFB1）和伏馬毒素B1（FB1）這5 種真菌毒素，本文對幾種提取方法進行了驗證和比對，期望獲得一種方便快捷、準確可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器與設備

Waters TQS 高效液相串聯質譜儀（美國Waters 公司）、PL602E 梅特勒電子天平（梅特勒-托利多公司）、TG16-WS 離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）、振蕩器（Talboys 公司）。

1.1.2 材料與試劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素B1（AFB1）及伏馬毒素B1（FB1）5 種標準溶液，購自Dr 公司；乙腈、乙酸銨、甲酸，均為色譜純，購自Merk 公司；Agilent 5982-6650 萃取包，購自Agilent 公司；CNW SBEQ-CA8805-H 凈化管，購自德國CNW 科技公司；0.22 μm 濾膜，購自天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 樣品提取

（1）方法1。準確稱取5.0 g 試樣（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 提取劑（含1%甲酸的50%乙腈水溶液），振蕩提取5 min，7 000 r·min-1條件離心5 min；取1.5 mL 上清液，加入凈化管渦旋1 min，7 000 r·min-1，離心5 min；取1 mL 上清液，氮吹至近干，用提取液定容至1 mL，過0.22 μm 的濾膜后，樣品用于UPLC-MS/MS 上機測定。

（2）方法2。準確稱取5.0 g 試樣（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 提取劑（含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液），振蕩提取40 min，加入QuEChERS 萃取包，振搖2 min 使其全部分散，7 000 r·min-1條件下離心5 min，取1.0 mL 上清液于凈化管中，振蕩提取1 min 后12 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清液過0.22 μm 的濾膜，樣品用于UPLC-MS/MS 上機測定。

（3）方法3。準確稱取5.0 g 試樣（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈，振蕩提取10 min，7 000 r·min-1條件下離心5 min，取1.0 mL 上清液加入到凈化管中，振蕩提取1 min 后12 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清液過0.22 μm 的濾膜后，樣品待測；余下樣品管取2.0 ml 上清液置于50 ℃水浴中氮吹至至近干，用50%乙腈水溶液定容至1.0 mL。兩份樣品同時用于UPLC-MS/MS 上機測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱ACQUITY BEH C181.7 μm（2.1 mm×50 mm），柱溫為40 ℃；進樣體積為1.0 μL；流動相A 為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液（含0.01%甲酸），流動相B 為乙腈溶液；流速為0.30 mL·min-1；梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1 超高效液相色譜的梯度洗脫程序表

1.3.2 質譜條件

離子源為電噴霧電離正離子模式（ESI+）；多反應監測掃描（MRM）；脫溶劑溫度為500 ℃；其他質譜參數見表2。

表2 5 種待測真菌毒素的質譜參數及條件表

1.3.3 標準溶液

5 種毒素標準溶液逐級依次稀釋成相應濃度（DON、3-AcDON、FB1濃度為0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1和0.8 mg·L-1，ZEN 濃 度 為0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.08 mg·L-1和0.10 mg·L-1，AFB1濃度為0.002 mg·L-1、0.004 mg·L-1、0.006 mg·L-1、0.008 mg·L-1和0.010 mg·L-1），作為標準曲線工作溶液，獲得5 種毒素標準曲線及線性相關系數。

2 結果與分析

2.1 3 種提取方法結果比對

DON、3-AcDON、ZEN 3 種毒素用50%、80%、100%乙腈提取溶劑提取效率均為80%以上，100%乙腈提取效率更優。AFB1使用含水提取溶劑提取效率不穩定且提取率較低；FB1使用純乙腈提取凈化后直接上機，沒有任何檢出，再次使用含50%乙腈水復溶后，檢測得到的回收率為80%以上。3 種提取方法提取后回收率情況見表3。

表3 3 種提取方法提取后回收率情況表

根據3 種提取方法的結果比對，最終選擇最優化的提取方法3。

2.2 方法檢出限與方法定量限

在1.3 儀器條件下，得到5 種毒素的總離子流如圖1 所示。

分別使用逐步稀釋法[9]得到5 種毒素的方法檢出限并以此評估得到方法的定量限，見表4。

2.3 方法準確度確認

分別對5 種毒素的定量限、2 倍定量限和10 倍定量限進行添加試驗[10]，得到結果表5，通過結果分析可見DON 的回收率在74%～90%，3-AcDON 的回收率在74%～90%，ZEN 的回收率在74%～90%，AFB1的 回 收 率 在74% ～90%，FB1的 回 收 率 在74%～90%。符合實驗室質量控制規范[10]。

圖1 5 種毒素的總離子流圖

表4 UPLC-MS/MS 測定5 種毒素的線性方程、方法檢出限及方法定量限表

表5 五種毒素在莧菜中的回收率和標準偏差表

3 結論

本實驗采用乙腈提取玉米中5 種常見真菌毒素，同時采用超高效液相串聯質譜法進行檢測。該方法方便、快捷且準確度高，可應用于玉米中5 種常見真菌毒素的檢測。