超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)玉米中 5 種真菌毒素的方法研究

◎ 郝國(guó)輝

（江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 南京 210036）

糧食在種植、收獲、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中易被真菌感染而產(chǎn)生真菌毒素，這些真菌毒素隨著糧食及其制品進(jìn)入食物鏈，最終可能引起人或動(dòng)物的致癌、致畸等病變[1]。我國(guó)玉米由于后期處理及儲(chǔ)存條件的原因，真菌毒素的污染較為嚴(yán)重[2]。黃曲霉毒素B1（AFB1）是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的真菌毒素；伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一類強(qiáng)毒和致癌性真菌毒素，其中伏馬毒素B1（FB1）是代表性成分之一；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又名嘔吐毒素，目前對(duì)糧食污染最為普遍[3]；玉米赤霉烯酮（ZEN）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，高溫下難分解，嚴(yán)重威脅肉類生產(chǎn)的安全和人類健康[4]。玉米中DON 和AFB1容易動(dòng)態(tài)積累，AFB1受生育期影響較大；ZEN 含量變化比較平穩(wěn)[5]。鑒于QuECHERS 技術(shù)與超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)[6-8]，為了同時(shí)檢測(cè)玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素B1（AFB1）和伏馬毒素B1（FB1）這5 種真菌毒素，本文對(duì)幾種提取方法進(jìn)行了驗(yàn)證和比對(duì)，期望獲得一種方便快捷、準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

Waters TQS 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）、PL602E 梅特勒電子天平（梅特勒-托利多公司）、TG16-WS 離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、振蕩器（Talboys 公司）。

1.1.2 材料與試劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素B1（AFB1）及伏馬毒素B1（FB1）5 種標(biāo)準(zhǔn)溶液，購(gòu)自Dr 公司；乙腈、乙酸銨、甲酸，均為色譜純，購(gòu)自Merk 公司；Agilent 5982-6650 萃取包，購(gòu)自Agilent 公司；CNW SBEQ-CA8805-H 凈化管，購(gòu)自德國(guó)CNW 科技公司；0.22 μm 濾膜，購(gòu)自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 樣品提取

（1）方法1。準(zhǔn)確稱取5.0 g 試樣（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 提取劑（含1%甲酸的50%乙腈水溶液），振蕩提取5 min，7 000 r·min-1條件離心5 min；取1.5 mL 上清液，加入凈化管渦旋1 min，7 000 r·min-1，離心5 min；取1 mL 上清液，氮吹至近干，用提取液定容至1 mL，過(guò)0.22 μm 的濾膜后，樣品用于UPLC-MS/MS 上機(jī)測(cè)定。

（2）方法2。準(zhǔn)確稱取5.0 g 試樣（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 提取劑（含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液），振蕩提取40 min，加入QuEChERS 萃取包，振搖2 min 使其全部分散，7 000 r·min-1條件下離心5 min，取1.0 mL 上清液于凈化管中，振蕩提取1 min 后12 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm 的濾膜，樣品用于UPLC-MS/MS 上機(jī)測(cè)定。

（3）方法3。準(zhǔn)確稱取5.0 g 試樣（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈，振蕩提取10 min，7 000 r·min-1條件下離心5 min，取1.0 mL 上清液加入到凈化管中，振蕩提取1 min 后12 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm 的濾膜后，樣品待測(cè)；余下樣品管取2.0 ml 上清液置于50 ℃水浴中氮吹至至近干，用50%乙腈水溶液定容至1.0 mL。兩份樣品同時(shí)用于UPLC-MS/MS 上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱ACQUITY BEH C181.7 μm（2.1 mm×50 mm），柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為1.0 μL；流動(dòng)相A 為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液（含0.01%甲酸），流動(dòng)相B 為乙腈溶液；流速為0.30 mL·min-1；梯度洗脫，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 超高效液相色譜的梯度洗脫程序表

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離正離子模式（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM）；脫溶劑溫度為500 ℃；其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 5 種待測(cè)真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)及條件表

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

5 種毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)依次稀釋成相應(yīng)濃度（DON、3-AcDON、FB1濃度為0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1和0.8 mg·L-1，ZEN 濃 度 為0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.08 mg·L-1和0.10 mg·L-1，AFB1濃度為0.002 mg·L-1、0.004 mg·L-1、0.006 mg·L-1、0.008 mg·L-1和0.010 mg·L-1），作為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，獲得5 種毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種提取方法結(jié)果比對(duì)

DON、3-AcDON、ZEN 3 種毒素用50%、80%、100%乙腈提取溶劑提取效率均為80%以上，100%乙腈提取效率更優(yōu)。AFB1使用含水提取溶劑提取效率不穩(wěn)定且提取率較低；FB1使用純乙腈提取凈化后直接上機(jī)，沒(méi)有任何檢出，再次使用含50%乙腈水復(fù)溶后，檢測(cè)得到的回收率為80%以上。3 種提取方法提取后回收率情況見(jiàn)表3。

表3 3 種提取方法提取后回收率情況表

根據(jù)3 種提取方法的結(jié)果比對(duì)，最終選擇最優(yōu)化的提取方法3。

2.2 方法檢出限與方法定量限

在1.3 儀器條件下，得到5 種毒素的總離子流如圖1 所示。

分別使用逐步稀釋法[9]得到5 種毒素的方法檢出限并以此評(píng)估得到方法的定量限，見(jiàn)表4。

2.3 方法準(zhǔn)確度確認(rèn)

分別對(duì)5 種毒素的定量限、2 倍定量限和10 倍定量限進(jìn)行添加試驗(yàn)[10]，得到結(jié)果表5，通過(guò)結(jié)果分析可見(jiàn)DON 的回收率在74%～90%，3-AcDON 的回收率在74%～90%，ZEN 的回收率在74%～90%，AFB1的 回 收 率 在74% ～90%，F(xiàn)B1的 回 收 率 在74%～90%。符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范[10]。

圖1 5 種毒素的總離子流圖

表4 UPLC-MS/MS 測(cè)定5 種毒素的線性方程、方法檢出限及方法定量限表

表5 五種毒素在莧菜中的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取玉米中5 種常見(jiàn)真菌毒素，同時(shí)采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。該方法方便、快捷且準(zhǔn)確度高，可應(yīng)用于玉米中5 種常見(jiàn)真菌毒素的檢測(cè)。