響應面法優化紅棗益生菌發酵飲料工藝

盛 潔，田 歡，劉原野，唐鳳仙*

（1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832003；2.新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832003）

紅棗（ZizyphusjujubeMill）又名大棗，是由鼠李科（Rhamnaceae）植被棗樹的成熟果實經暴曬脫水而成的呈紅色或深紅色的干果[1]。紅棗是食藥兩用水果，具有補氣養身、抗衰老、生理保健等功效[2-3]。紅棗中含有多種豐富的維生素和微量元素及生物活性成分[4]，具有深入研究的價值。新疆是中國優質紅棗的栽培基地，而目前新疆的紅棗產品種類單一，加工形式主要還是以干制或粗制加工為主，如干制紅棗、紅棗速溶粉和紅棗濃縮汁等[5-6]。目前紅棗精深加工類產品相對較少，致使每年市場上的紅棗處于超額狀態，因此開發紅棗精深加工的產品是提高紅棗的經濟價值，帶動紅棗產業發展的有效途徑。

益生菌是指具有一定生命力，且對宿主有益的活性微生物。當動物宿主攝入一定數目的菌群時會產生健康功效，能對動物機體產生有益的生物活性物質，同時還可以維持機體腸道微生物處于平衡的狀態[7]。益生菌中部分乳酸菌在發酵飲料中還具有益生功能[8]，對降低膽固醇、降血清和降血壓等具有一定的功效[9]。還可改善果汁的風味，提高果汁的營養價值，防止果汁變壞，延長保存期，增加保健作用，其功效有益于提高人體健康水平[10]。其中，丹尼斯克商業混合菌種（乳桿菌類、雙岐乳桿菌類、革蘭氏陽性球菌等）已被臨床證實對改善人體胃腸道、提高免疫力等具有一定的療效[11]。除此之外，益生菌的生長還與其他物質有關，如紅棗中的紅棗多糖不僅是紅棗中重要的功能性成分，具有很多生理保健的功能[12]，還會對乳酸菌的生長產生一定的影響。適量的紅棗多糖能夠增加乳酸菌活菌數，提高產品品質[13]。益生菌發酵飲料口感清爽酸甜，受到大眾的普遍青睞，但關于益生菌發酵紅棗飲料的工藝還需進一步探索和優化。

本研究以阿克蘇紅棗為原料，利用丹尼斯克商業菌種發酵紅棗制作飲料，并以感官評價和活菌數為評價指標，設計單因素試驗和響應面試驗，確定最佳發酵工藝參數，以期為紅棗益生菌發酵飲料加工工藝開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌種

阿克蘇紅棗：市售；丹尼斯克商業菌種YO-MIX 207、YO-MIX 863、YO-MIX 883（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌及不影響酸奶質構的乳雙歧桿菌或嗜酸乳桿菌）：丹尼斯克（中國）有限公司。

1.1.2 化學試劑

ROHAVIN Flash果膠酶（酶活100 U/g）：新疆鼎唐貿易公司；碳酸鈉、葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、硫酸錳、吐溫-80（均為分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司；硫酸鎂、檸檬酸氫二銨、酵母膏、瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨（均為分析純或生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

MC202231手持折光儀：四川成都泰光學有限公司；TD-A型分析天平：余桃金諾天平儀器有限公司；WMS-PB108奧科打漿機：江西南昌田汀廚具有限公司；F50型膠體磨：沈陽航天新光超微粉碎機械有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；GJJ-0.03T/70Mpa型高壓均質機：上海諾尼輕工機械有限公司；pHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SPX-250B型生化培養箱：常州諾基儀器有限公司；LDZX-30KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 益生菌發酵紅棗飲料工藝流程

紅棗篩選→去核→混合打漿（紅棗∶蒸餾水=1∶5）→過膠體磨→浸提（0.05%果膠酶，45 ℃，2 h）→過濾→均質→調配→高溫殺菌（90 ℃，20 min）→接種發酵→成品

1.3.2 工藝操作要點

紅棗篩選、去核、混合打漿：挑選顆粒飽滿、無霉病的干制紅棗，用去離子水清洗并瀝干水分。將清洗好的紅棗去核，隨后與蒸餾水混合打漿120 s。

過膠體磨：通過膠體磨將紅棗汁中的顆粒打磨更細碎[14-15]。

浸提：向混合打漿好的紅棗原料中加入0.05%果膠酶后放入45 ℃的水浴鍋中水浴浸提2 h，使紅棗與蒸餾水充分融合，提高紅棗的浸出物，充分釋放紅棗的香味物質與有效成分[16]。

過濾：將紅棗汁用8層紗布濾去果肉，后用150目篩網進行過濾，以確保汁液能夠通過均質機。

均質：將過濾完的紅棗汁通過高壓均質機處理。

調配：均質后用碳酸鈉將其pH調至適宜菌種生長的范圍，用手持折射儀測量可溶性固形物含量。

高溫殺菌：浸提液進行高溫殺菌（90 ℃水浴環境中殺菌20 min）[17]，隨后冷卻至室溫備用。

接種發酵：稱取適量的丹尼斯克菌種，加入5%的葡萄糖水溶液10 mL，將菌種活化培養30 min（活化后的活菌數為6.0 lg（CFU/mL））；隨后在無菌環境下，將其接種于滅菌冷卻好的浸提液中，然后在恒溫培養箱中控溫發酵，并定期進行攪拌測其pH值，當發酵一定時間pH降至合適范圍時則終止發酵，即得益生菌發酵紅棗飲料。

1.3.3 紅棗益生菌發酵飲料發酵工藝優化單因素試驗

以紅棗飲料的感官評價和活菌數作為考察指標，設置菌種型號（YO-MIX 207、YO-MIX 863、YO-MIX 883）、紅棗含量（10%、20%、30%、40%、50%）、初始pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、菌種添加量（0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%）、發酵溫度（35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃）、發酵時間（36 h、39 h、42 h、45 h、48 h）為單因素變量，考察其對紅棗飲料感官評分和活菌數的影響。

1.3.4 紅棗益生菌發酵飲料發酵工藝優化響應面試驗

以單因素試驗得到的最佳參數為基礎，采用Design-ExpertV8.0.6響應面軟件對菌種添加量（A）、初始pH值（B）、發酵溫度（C）及發酵時間（D）設計4因素3水平的響應面優化試驗，以感官評分和活菌數為響應值，并對試驗進行回歸分析。Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization

1.3.5 感官評價標準

選取10名經過感官評價培訓的人員，按照表2的評分準則對產品進行綜合評定打分，最終評定結果取平均值（滿分100分）。

表2 益生菌發酵紅棗飲料的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards for probiotics fermented jujube beverage

續表

1.3.6 指標檢測方法

可溶性固形物含量測定：使用手持折射儀測定樣品的可溶性固形物。總糖含量測定：采用直接滴定法測定樣品的總糖含量[18]。pH的測定：使用pH計測定樣品的pH值；乳酸菌活菌數量測定：活菌計數按照梯度稀釋平板涂布的方法進行培養觀察，以CFU/mL來表示活菌數[19]。

總酸含量的測定：采用酸堿滴定法進行測定[20]，總酸（total acid，TA）含量計算公式如下：

式中：TA為總酸含量（以乳酸計），g/L；c為氫氧化鈉標準滴定液的濃度，mol/L；v1為滴定時消耗氫氧化鈉標準液的體積，mL；v2為空白樣品消耗氫氧化鈉標準液的體積，mL；v3為液體樣品的體積，mL；90為乳酸的摩爾質量值，g/mol。

1.3.7 數據處理

采用Design-ExpertV8.0.6以及Origin 8.0處理數據。

2 結果與分析

2.1 發酵條件優化單因素試驗

2.1.1 菌種對感官評分和活菌數的影響

由圖1可知，不同菌種發酵得到的紅棗飲料之間感官評分與活菌數各不相同，且差異性較大，造成這種差異性可能是由于不同菌種所具有的性能不同所致，每個菌種生長繁殖的代謝產物不盡相同，因而對最終產品的口感及活菌數產生影響，活菌數的不同可能還與活性菌種的活度有關，不同活性干粉菌種自身所配比的營養成分與比例各不相同，在發酵時乳酸菌發揮作用的時間與生長程度就會有所差異，由圖1可知，菌種YO-MIX 863的感官評分與活菌數最高。故綜合考慮，最佳的菌種為YO-MIX 863。

圖1 菌種對紅棗飲料感官評分和活菌數的影響Fig.1 Effects of strain on sensory score and viable count of jujube beverage

2.1.2 紅棗含量對感官評分和活菌數的影響

由圖2可知，隨著原料比例的增多，感官評分出現先增大后減少的趨向，在紅棗含量為20%時，感官評分達到最大，為89分，這是因為隨著紅棗含量的增多，紅棗飲料的糖度在逐步增大，而發酵過程中產生的酸度是固定的，致使紅棗飲料的糖酸比例失衡，口感變膩，感官評分下滑；活菌數隨著紅棗含量的增多也出現先增大后減少的趨向，在紅棗含量為20%時達到最大，這可能是由于紅棗含量的增多使料液比例失衡，在浸提與發酵時紅棗中的營養物質無法完全浸出與分解，無法提供菌種生長所需的營養成分，近而使得乳酸菌的生長繁殖受到限制，活菌數量出現下降。故綜合上述因素，得到最佳紅棗含量為20%。

圖2 紅棗含量對紅棗飲料感官評分和活菌數的影響Fig.2 Effect of jujube content on sensory score and viable count of jujube beverage

2.1.3 初始pH值對感官評分和活菌數的影響

由圖3可知，初始pH值在4.5～6.0的范圍內，感官評分與活菌數的變化是隨著pH的增大呈上升的趨勢，且增幅較大，變化趨勢與pH的變化呈正相關關系；感官評分在pH為6.0時達到最大，為96分，隨后pH增大感官評分減小，而活菌數隨著pH的進一步增大呈現出升高的趨勢；這可能是由于乳酸菌的特殊生長環境所致，乳酸菌在pH趨于中性的環境中其生長繁殖能力最佳，生長效果作用最為顯著，因為大多數菌種的耐酸性效果并不佳，在酸性較強的環境中菌種就會失去活性，而乳酸菌在生長繁殖過程中會代謝出大量的乳酸等酸類化合物[21]，會對菌種的生長產生影響，故發酵環境pH越趨于中性，其在發酵過程中的酸度增加就越緩慢，對乳酸菌的生長繁殖就越有利；感官評分在pH為6.5時出現下降是因為pH趨中性影響了產品最終的口感，使得口感體驗較差。綜合考慮得到最佳初始pH值為6.0。

圖3 初始pH值對紅棗飲料感官評分和活菌數的影響Fig.3 Effect of initial pH value on sensory score and viable count of jujube beverage

2.1.4 菌種添加量對感官評分和活菌數的影響

由圖4可知，隨著菌種添加量的加大，在0.03%～0.09%范圍內感官評分呈上升趨勢，且增幅較大，在0.09%～0.15%呈下降趨勢，在菌種添加量0.09%時感官評分最高為93分；活菌數的變化以0.12%為分界點，呈現先升高后下降的趨勢，在菌種添加量為0.12%時到達最高值8.7 lg（CFU/mL），這可能是因為當菌種量增多時，其生長繁殖需要更多的營養成分，但發酵液中的營養成分有限，不能供給過多菌種的生長，從而影響乳酸菌的生長繁殖，且乳酸菌添加量過多在發酵時產生的酸類化合物較多，影響產品最終的口感，菌種添加量過少時發酵速率緩慢，更易于受到有害菌的污染，影響產品的品質[22-23]，使得感官評分降低，且產品最終的活菌數也達不到要求。綜合感官評分和活菌數的變化，得到菌種最佳添加量為0.09%。

圖4 菌種添加量對紅棗飲料感官評分和活菌數的影響Fig.4 Effect of strain addition on sensory score and viable count of jujube beverage

2.1.5 發酵溫度對感官評分和活菌數的影響

由圖5可知，當發酵溫度為37 ℃時，感官評分與活菌數都到達最高值，在37 ℃之后隨著發酵溫度的上升，感官評分與活菌數都呈現下降的趨勢，這可能是菌種的耐熱性較差所致，溫度較高對乳酸菌的生長活性有影響，溫度過高時乳酸菌就會失去活性，從而影響發酵進程和最終的產品活菌數[24]；感官評分在37 ℃達到最大值91分，感官評分的變化可能是因為發酵溫度過高時會影響飲料中的果香味物質，破壞香味物質的化學組成，影響飲料的品質，而溫度較低時能較好的保留住這種香味物質，提高飲料的果香味。故綜合思量，得到最佳的發酵溫度為37 ℃。

圖5 發酵溫度對紅棗飲料感官評分和活菌數的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on sensory score and viable count of jujube beverage

2.1.6 發酵時間對感官評分和活菌數的影響

由圖6可知，隨著發酵時間的延長，感官評分和活菌數都出現先升高后降落的變化趨勢，當發酵時間為42 h時，兩者都出現最大值，這可能是因為發酵時間過短時乳酸菌發酵沒有達到最佳效果，其代謝產物不夠豐富，對飲料品質沒有明顯的提升，生長繁殖也受到限制，活菌數達不到要求；發酵時間過長時，乳酸菌的生長代謝產物乳酸過多，提高了發酵液的酸性，而菌種在酸性環境中容易失去活性，耐酸性較差，致使乳酸菌活菌數下降[25]，同時酸性的上升影響產品的糖酸平衡，使得感官評分下降。綜合考慮感官評分與活菌數的變化，得到最佳發酵時間為42 h。

圖6 發酵時間對紅棗飲料感官評分和活菌數的影響Fig.6 Effect of fermentation time on sensory score and viable count of jujube beverage

2.2 紅棗益生菌發酵飲料響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面設計方案與結果

根據發酵單因素試驗優化結果，采用響應面法對菌種添加量（A）、初始pH（B）、發酵溫度（C）及發酵時間（D）進行響應面優化試驗，建立4因素3水平的響應面設計方案，響應面的響應值設為感官評分（M）和活菌數量（N），響應面設計方案與結果見表3。

表3 發酵條件優化響應面設計與結果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization

續表

2.2.2 建立回歸模型和方差分析

采用響應面軟件對表3進行統計分析后，得到感官評分和活菌數量的多元二次回歸方程如下所示：

對感官評分（M）和活菌數（N）的多元回歸二次方程進行模型方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

結果表明，感官評分（M）和活菌數（N）的回歸模型顯著性結果顯示P＜0.001，為極顯著，失擬項為P=0.089 0/0.070 5，失擬項結果為不顯著，說明兩種模型為差異極顯著，感官評分（M）和活菌數（N）與4個響應因素間的線性顯著關系為極顯著；兩個模型的相關系數為R2（M）=0.980 6，R2（N）=0.953 7，校正系數為R2Adj（M）=0.961 1，R2Adj（N）=0.943 1，說明兩個模型的回歸擬合度較好，更接近實際試驗，且校正系數值說明兩個模型僅有3.89%和5.69%的變異情況不能采用此模型的回歸方程解釋，綜合分析，得出此回歸模型可用于對發酵工藝的響應面因素進行分析和預測。

由表4的顯著性結果可知，感官評分的回歸模型中一次項A、B、C、D和交互項CD對結果影響極顯著（P＜0.01），二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），其余都為不顯著（P＞0.05）；活菌數的回歸模型中一次項A、D對結果影響顯著（P＜0.05），一次項B、C和二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01）。此外，通過F值大小可反映出各響應面因素對產品感官評分的影響因次順序為：初始pH值（B）＞發酵溫度（C）=發酵時間（D）＞菌種添加量（A），對活菌數的影響因次順序為：發酵溫度（C）＞初始pH（B）＞菌種添加量（A）＞發酵時間（D）。

2.2.3 響應面因素交互分析

通過模型方程繪制的響應面圖和等高線圖可直觀體現出響應面因素菌種添加量（A）、初始pH（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）與響應值感官評分（M）和活菌數（N）間的關系及各響應因素間的交互作用關系。根據各因素間的三維響應面圖和等高線圖判定各因素間交互作用的強弱，也能反映出兩因素間的交互作用對響應值的影響大小。等高線圖為橢圓形則代表兩者交互作用強，反之則代表交互作用弱[26]；而三維響應面圖曲面坡度幅度則代表響應值的變化幅度，曲面坡度越陡，對響應值的影響越大，反之則越小[27]。

由圖7可知，響應值感官評分（M）和活菌數（N）隨著4個響應因素的增大呈現先上升后下降的趨勢，其中感官評分（M）與四個響應因素之間形成的三維響應面圖坡面較陡，坡度較大，說明四個響應因素對感官評分（M）影響較大。活菌數（N）與菌種添加量（A）、初始pH值（B）及發酵溫度（C）間形成的三維響應面圖坡面較陡，說明這三個響應因素對活菌數（N）影響較大，而發酵時間（D）的三維響應圖坡面較緩，坡度較小，說明發酵時間（D）對活菌數（N）影響較小。同時發酵溫度（C）與發酵時間（D）對感官評分（M）的影響是顯著（P＜0.05）。

圖7 各因素交互作用對益生菌發酵紅棗飲料感官評分與活菌數影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on sensory score and viable count of probiotics fermented jujube beverage

2.2.4 響應面模型驗證試驗

根據響應面軟件分析得出4個響應因素對活菌數影響所得工藝參數分別菌種添加量0.09%、初始pH6.08、發酵溫度37.43 ℃、發酵時間42.52 h，活菌數可達8.796 lg（CFU/mL）；對感官評分影響所得的工藝參數為菌種添加量0.1%、初始pH6.19、發酵溫度37.4 ℃、發酵時間42.87 h，感官評分可達95.239分。在此基礎上，該工藝以活菌數為首要參考指標，感官評分為次要參考指標，且在活菌數最優的工藝條件下，所得感官評分為95.035分，對產品并未產生顯著影響。

最終確定益生菌發酵紅棗飲料的工藝參數為：菌種添加量0.09%、初始pH6.08、發酵溫度37.43 ℃、發酵時間42.52 h。為驗證模型預測的工藝參數可靠性，根據實際情況，對上述工藝參數微調，最終實際工藝參數為菌種添加量0.09%、初始pH值為6.0、發酵溫度37 ℃、發酵時間42 h，感官評分為95分，活菌數為8.6 lg（CFU/mL），實際數值與模型預測數值基本一致，故該多元線性回歸模型基本準確。

2.2.5 益生菌發酵紅棗飲料產品指標檢測結果

通過此工藝參數得到的紅棗飲料為褐黃色，且香氣濃郁，酸甜適口，感官評分為95分。理化指標中，活菌數可達（8.60±0.12）CFU/mL，總糖含量可達（56.24±0.53）g/L，總酸含量可達（4.82±0.24）g/L。微生物指標中，大腸桿菌數量≤5 MPN/100 mL，未檢出致病微生物，符合GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》標準要求[28]。

3 結論

本試驗以新疆阿克蘇紅棗為發酵原料，利用乳酸菌發酵紅棗益生菌飲料。以原料比、初始pH、發酵時間和發酵溫度設計發酵工藝單因素試驗，并在此基礎上以感官評分及活菌數為響應值進行響應面分析試驗。得到優化后的工藝參數為菌種添加量0.09%、初始pH值為6.0、發酵溫度37.43 ℃、發酵時間42.52 h，在此優化條件下，總糖含量為56.24 g/L，活菌數為8.6 lg（CFU/mL），感官評分可達95分。產品呈褐黃色，口感爽滑，酸甜適宜。結果表明，響應面模型驗證實驗具有可靠性，為進一步優化紅棗益生菌發酵產品提供參考依據。