清香型白酒釀造核心功能微生物的研究與應用

杜艾明，李 良，李俊薇，胡申才*

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.黃鶴樓酒業有限公司，湖北 武漢 430050）

清香型白酒主要是以其無色、清亮透明、清香純正等特點深受廣大消費者的喜愛。除了大家熟知的山西汾酒、湖北黃鶴樓酒以及北京二鍋頭之外，河南寶豐酒、浙江同山燒、河南龍興酒、青稞酒、廈門高粱酒和天長帝酒等也都屬于清香型白酒。

清香型白酒具有“清香純正，醇甜柔和，自然諧調，余味爽凈”的風格特點。這些風格特點與清香型白酒的“清蒸清茬、地缸發酵、清蒸二次清”釀造工藝特點是緊密相關聯的。清香型白酒釀造工藝講究的就是“清字當頭，凈字到底”，那么該釀造工序中微生物群落組成和演化交替過程是怎么樣的呢？釀造過程中產生了哪些風味物質？這些風味物質是如何代謝產生的？要回答好這些問題，就需要剖析微生物群落組成和解析風味代謝物質成分及形成機理，而隨著微生物基因組學、轉錄組學及代謝組學相關技術的發展，這些研究熱點問題都得到了一定程度的解答。本文對近年來清香型白酒釀造的微生物群落組成、核心微生物組成及相互作用和主要代謝風味物質及產生機理進行了歸納總結，以期為同行提供參考，推陳出新，釀造出質量更好、營養健康價值更高的清香型白酒。

1 清香型白酒釀造工藝

從不同曲法發酵來看，清香型白酒主要有大曲清香、小曲清香、麩曲清香。大曲酒的生產工藝通常采用“清蒸清燒、地缸發酵、清蒸兩次清”。該工藝將發酵所用的粉碎高粱和輔料進行蒸煮處理，將蒸煮后的高粱拌入低溫大曲和輔料，置于埋入土中的陶瓷缸中發酵28 d后蒸得第一次酒，即大米查酒。蒸餾后的酒醅不再配入新料，只加曲和輔料后即可進行第二次發酵，28 d后取出蒸得第二次酒，即二米查酒。將兩次蒸餾后的酒儲存一定年限經勾兌即得清香型白酒[1-2]。

2 釀造微生物群落組成及分布

釀造過程復雜，是自然發生的“多微共酵”固態發酵過程。曲粉作為發酵起始劑，在發酵過程的微生態中擔負著重要作用，但環境微生態因素和地缸不同相位所創造的不同小微生態位的影響作用也不容小覷。

2.1 大曲微生物群落組成

曲為酒之魂，不同來源的大曲，其中所含微生物種類也有著差別。ZHENG X W等[3]采用傳統分離培養結合聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術從汾酒大曲中檢測到109種細菌和81種真菌，其中地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）占到了細菌總數的57%，另外短桿菌（Brevibacteriumsp.）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等乳酸菌分別占到總細菌數的4%、17%、6%和6%。在DGGE法中還發現了傳統培養法未分離得到的食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、三叉乳酸桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、乳酸乳桿菌（L.lactis）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；葉光斌等[4]通過構建細菌16S rRNA基因文庫、限制性片段長度多態性（restricted fragment length polymorphism，RFLP）指紋圖譜分析、測序和系統發育學分析發現大曲中的細菌包括乳桿菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）和高溫放線菌（Thermoactinomyces）等細菌；蘭玉倩等[5]研究發現，清香型白酒大曲中含有腹膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）等酵母菌。WANG H Y等[6]通過PCR-DGGE技術對幾種大曲微生物群落比較分析后發現大曲中含有的乳酸菌極具豐富多樣性，是絕對的優勢細菌；扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）是主要的酵母菌，也含有一些季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）等非釀酒類酵母。霉菌主要以米曲霉（Aspergillus oryzae）和布氏犁頭霉（Absidia blakesleeana）為常見菌。

2.2 釀造環境微生物群落

不同的生態環境，甚至不同的廠區都可能有著不同的微生物群落組成。WANG X S等[7]通過高通量測序技術比較新廠區酒醅及老廠區酒醅中微生物種群演替規律，發現不同環境酒醅初始微生物種群結構不同，并進一步造成了酒醅中微生物演替規律及代謝的差異；同時還發現老廠區環境中白酒發酵功能微生物相對豐度高于新廠區。其中釀酒車間室內地面及工具富集了豐富的白酒釀造功能微生物，細菌種群主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella），真菌種群主要包括畢赤酵母屬（Pichia）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、酵母屬（Saccharomyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）和曲霉屬（Aspergillus）。

2.3 地缸中不同相位微生物群落組成

固態發酵以氣相為連續相，這就使系統內的物質、熱量和動量傳遞受阻，產生的“空間位阻效應”創造了不同的小微生態位，有效地避免了微生物之間的競爭，從而保持了白酒發酵過程中的微生物多樣性[8]。王雪山等[9]利用高通量測序技術分析不同位置酒醅中微生物種群結構及演替規律，結果表明清香型白酒發酵過程中優勢細菌種群包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和片球菌屬（Pediococcus），優勢酵母真菌種群包括畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、復膜孢酵母屬和哈薩克斯坦酵母（Kazachstania）。不同位置酒醅微生物種群結構在屬水平存在明顯差異。同時，上層酒醅微生物種群演替速率慢于中、下層酒醅，最終造成上層酒醅乙醇產生速率低于中、下層酒醅。雷振河[10]應用高通量測序技術以發酵第10天的地缸酒醅樣品為研究對象，發現地缸酒醅面層往下20 cm處的地缸中心部位酒醅和靠近地缸缸壁酒醅中的微生物組成大體相同，但原核微生物中的醋酸桿菌科、乳桿菌科和芽孢桿菌科，以及真核微生物中的假絲酵母和畢赤酵母科等5種優勢微生物豐富度明顯不同，且雙足囊菌科（Dipodascaceae）、復膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）、小囊菌科（Microascaceae）等真菌僅存于中心酒醅中，在地缸缸壁邊緣基本不存在。

3 核心功能微生物及其作用

不同的發酵食品由不同的核心微生物組成，這些核心微生物也為發酵食品的風味多樣性和產品質量的穩定性提供了重要保證[11]。一般來說，清香型白酒酒醅發酵過程中的核心微生物群主要由不同種屬的乳酸菌、醋酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌和少數霉菌等組成。

3.1 乳酸菌

乳酸菌以代謝產物命名，是利用碳水化合物（主要指葡萄糖）發酵成乳酸的一類菌群的統稱，在白酒釀造過程中發揮著重要作用。除主要代謝產物乳酸外，乳酸菌也可產生其他有機酸。乳酸是一種重要的酒味調和物，既能掩蓋酒精的刺激性，還能使酒體協調柔和。另外乳酸還可以通過酯化作用與乙醇縮合生成乳酸乙酯，形成主體香氣成分之一。陳申習等[12]從清香型小曲酒機械化釀造車間發酵過程中的酒醅中分離鑒定得到了干酪乳桿菌（Lacto bacillus casei）、短乳桿菌（L.brevis）、希式乳桿菌（L.hilgardii）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）4種乳酸菌。李銳等[14]從小曲清香型勁酒酒醅中分離到植物乳桿菌（L.plantarum）、副干酪乳桿菌（L.paracasei）、短乳桿菌（L.brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、發酵乳桿菌（L.fermentum）、布氏乳桿菌（L.buchneri）和類布氏乳桿菌（L.parabuchneri）7種乳酸菌。其中植物乳桿菌（L.plantarum）、短乳桿菌（L.brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和副干酪乳桿菌（L.paracasei）4種為產乙酸細菌；植物乳桿菌（L.plan-tarum）和發酵乳桿菌（L.fermentum）為產乳酸細菌；植物乳桿菌（L.plantarum）、布氏乳桿菌（L.buchneri）和類布氏乳桿菌（L.parabuchneri）可產丁酸。

3.2 芽孢桿菌

芽孢桿菌是環境中存在非常廣泛的一類微生物，隨著對釀造中微生物的不斷探索和發酵機理的研究，發現芽孢桿菌在中國主流大曲白酒發酵中確實起著非常重要的作用。楊春霞等[13]從牛欄山地缸酒醅中篩選出5株芽孢桿菌，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。不同的芽孢桿菌可產生不同風味貢獻物質，如地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）與含氮化合物，蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）與醛酮類物質，短小芽孢桿菌（B.pumilus）與烴類和醇類物質，以及枯草芽孢桿菌（B.licheniformis）與雜環類化合物。

李銳等[14]從勁酒酒醅中分離到甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）等3種芽孢桿菌，它們都能分解蛋白質，其中甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）為好氧菌，還具有分解淀粉的作用。

3.3 酵母

王薇等[15]從清香型白酒固態釀造過程中共鑒定出10種酵母，分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、異常威克漢姆酵母（Wick erhamomyces anomalus）、扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、發酵畢赤酵母（P.fermentans）、阿薩希絲孢酵母（Trichosporonasahii）、耐滲透壓有孢漢遜酵母（H.osmophila）、粉狀畢赤酵母（P.farinose）、膜璞畢赤酵母（P.membranifa ciens）和葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）。其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和異常威克漢姆酵母（W.anomalus）是白酒釀造過程中最核心的3種酵母菌。

乙酸乙酯的主要合成途徑是酵母菌代謝，而乳酸乙酯的主要合成途徑是乳酸菌產生的乳酸在和酵母菌產生的醇在酯化酶催化作用下合成的。研究指出，白酒發酵中，產酯能力強的酵母有漢遜酵母（Hansenula polymorpha）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、假絲酵母（Candida）、酒香酵母（Brettanomyces）、白地霉（Geotrichum candidum）等[16-17]。

此外，研究發現扣囊腹膜孢酵母（S.fibuligera）可產生大量糖化酶，具有很強的糖化作用，在將淀粉轉化為葡萄糖的過程中擔負著重要的作用；WU Q等[18]還研究發現，酵母在代謝過程中可產生多種萜類活性物質。

3.4 霉菌

霉菌往往出現于發酵前期，隨著氧氣的消耗，霉菌含量也隨之降低。綜合來看，清香型白酒發酵過程中的霉菌主要有犁頭霉、曲霉、根霉和毛霉等[19-20]。

清香型白酒酒醅中的霉菌主要來源于大曲，在釀造過程中，霉菌的數量不再增殖，參與發酵過程的主要是霉菌的酶，其酶活性發揮的作用是降解原料大分子[21]。產生的糖化酶、液化酶將淀粉分解為葡萄糖，供酵母代謝利用而產生乙醇，再通過酯化酶促進釀酒過程中不同酯類物質的形成。

4 功能菌在清香型白酒中的應用

4.1 酯化和糖化功能菌的應用

酯類物質在白酒中起著呈香作用，近年來有不少關于高產酯酵母在生產中應用的研究報道。楊強等[22]在將從酒曲中篩選出的Y29擴大培養后制成酵母麩曲，并應用于中試車間發酵，發現其乙酸乙酯含量比對照組分別提高了99.4%，達到2.004 g/L，正丙醇含量卻下降了44.2%。曹苗文等[17]研究發現，在清香型白酒生產中在大曲中添加高酯曲，大楂酒總酯提高了2.350 g/L，乙酸乙酯含量提高了1.167 g/L，乳酸乙酯含量提高了0.670 g/L。管健等[23]在使用酯化紅曲、生香酵母和釀酒酵母作強化麩曲時發現，發酵過程中升溫速度會加快，對淀粉的利用率高，乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也得到了提高。

扣囊腹膜孢酵母可分泌高活力的淀粉酶（α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、生淀粉糖化酶）、β-葡萄糖苷酶等水解酶類，既能水解α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵，又能水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵[24]，將其作為發酵添加液加入酒醅發酵，可明顯改善牛欄山清香型白酒的香氣，并增強醇甜味[25]。進一步研究表明，扣囊復膜孢酵母在高粱培養基中可以生成牛欄山二鍋頭白酒中重要的6種香氣成分[26]。潘天全等[27]在小曲清香型白酒拌曲發酵時添入0.5%的安琪根霉曲，研究結果表明根霉曲配合小曲使用明顯協同促進了糧醅的糖化作用，酸類和酯類等揮發性風味成分種類增加，乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量提高明顯，乙酸乙酯與乳酸乙酯比由1.42提高到1.92，使得原酒風味更為諧調，清香更為純正。

4.2 調降乳酸乙酯含量的微生物技術開發

清香純正主要是指清香型白酒的主體香味物質乙酸乙酯與乳酸乙酯搭配諧調，具有清雅、純正、舒適、協調的復合香氣。但在清香型白酒的生產過程中，乙酸乙酯與乳酸乙酯比例失調也是一個普遍存在的問題。乳酸乙酯含量過高，則會影響酒的口感，導致酒體放香不足和香氣欠協調、后味澀苦等問題，從而降低白酒品質。

乳酸乙酯的產生依賴于乳酸的合成，酒醅中能形成乳酸的微生物多樣復雜，難以調控。因此如何降低乳酸含量是調降乳酸乙酯的重要突破口，而“降乳菌”的篩選應用是一條可行途徑，如牛欄山酒廠從清香型大曲中篩選出1株可降解乳酸的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌可有效降低白酒中乳酸乙酯的含量，乙酸乙酯與乳酸乙酯比例失調的問題得到了很好的解決[28]。

4.3 功能菌在風味物質代謝合成與調控方面的應用

四甲基吡嗪是中國白酒中廣泛存在的微量成分，能賦予酒體以咖啡和堅果的獨特香氣，還能發揮抗氧化、提高免疫力和防止肝纖維素化等多種生理作用。因此，四甲基吡嗪已公認為是白酒中有益于健康的一類風味活性功能物質。艾金鐘等[29]將蛋白酶活性較高的芽孢桿菌菌株，應用于紅星二鍋頭酒生產中后，原酒中四甲基吡嗪含量可達到0.010 g/L。

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物（isoprenoids），有著重要的生物學功能和應用價值，生物醫學研究表明萜類具有抗癌、消炎、降糖、預防心腦血管疾病、延緩衰老等藥理功效。其實，清香型白酒中存在的芳樟醇（linalool）、α-松脂醇（α-terpineol）、橙花叔醇（nerolidol）、香葉醇（geraniol）、大馬烯酮（β-damascenone）和金合歡醇（farnesol）也是一類重要的風味物質[30]，WU Q等[18]研究發現，釀酒酵母、東方伊薩酵母和異常漢遜酵母不但能生物轉化利用高粱等谷物中含有的萜類前體物，還能從頭合成芳樟醇等萜類物質，賦予清香白酒獨特的風味。

5 結語

微生物無疑是支撐酒體質量的基礎與核心，研究微生物群落組成、來源與其消長規律以及風味物質的代謝調控機制，以及主要功能菌間的互作關系，對于提升白酒產品競爭力至關重要。目前國內外白酒微生物研究者借助先進的高通量測序技術，可對傳統白酒釀造過程及大曲、環境中微生物的可培養微生物和未培養微生物同時進行分析解讀，還可借助氣質聯用等分析儀器對風味物質進行可視化的痕量分析，這為白酒微生物的研究提供了技術支撐，也為揭示釀酒過程中所發生的各種內在反應本質奠定了基礎。

白酒釀造環境與工藝都較為特殊，系統相對開放，但又存在自身的微生態系統，多種微生物共同發酵，制曲過程和釀造過程中均發生著復雜的生理生化反應。迄今為止，行業內對復雜微生態系統內存在的微生物種類多樣性和代謝多樣性以及微生物各類群之間的相互作用關系還缺乏清晰的認識。核心功能微生物資源的挖掘以及代謝機制的解析，對于解決不同原料和季節差異而導致的酒體非均一性以及低出酒率必將發揮出重要作用。