不同濃度鎘對煙草幼苗生長發育及生長素相關基因表達的影響

羅勇, 焦桂珍, 劉勝波, 魏躍偉, 邵惠芳, 賈宏昉*

(1.河南農業大學煙草學院, 鄭州 450002; 2.史丹利化肥寧陵有限公司, 河南 商丘 476000)

重金屬鎘(Cd)的生物毒性很強，是植物生長發育的非必需元素[1]。近年來，工業和農業生產不同程度地將鎘排放到土壤環境中，成為危害最大、分布最廣的農業污染物之一[2]。2014年,我國土壤鎘的點位超標率為7.0% ，位居8種無機污染物之首[3]。在土壤-植物系統中，鎘較其他重金屬更易遷移，可通過植物根系的吸收在植株體內積累[4]，造成生態環境污染和農產品品質下降[5]，并通過食物鏈危害人體健康[6-7]。鎘是人體最易積累的毒性物質，半衰期長達6.2～18年[8]。鎘積累到一定程度時，就會對植物產生毒害[9-11]，包括影響細胞分裂，降低生長速率[12]，破壞光合作用[13-14]，影響植物酶活性與膜完整性，促進脂質過氧化[15]等。通常植株會出現發育緩慢、矮小、葉片失綠等癥狀，進而作物產量和質量降低。

煙草作為我國乃至世界上一種非常重要的經濟作物，有著較強的鎘富集能力。鎘積累過量降低煙草的品質和產量，并在卷煙抽吸過程中通過煙氣進入人體，影響人體健康。目前鎘對煙草生長發育的作用機制研究已有一定的進展，但大多數研究集中在抗氧化性方面，鎘對煙草幼苗生長素及相關基因表達的影響報道較少。生長素是調節植物發育、參與脅迫反應中根系構型變化的一種關鍵激素。

因此，本研究以能標記生長素的DR5∷GUS云煙87轉基因煙草為試驗材料，探究不同濃度鎘處理對煙草生物學特性、MDA含量、生長素水平及NtYUCCA、NtPINs基因家族表達的影響，揭示不同濃度鎘對煙草生長發育的作用機理，以期為控制煙草重金屬鎘含量，提高煙葉安全性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所使用的煙草材料為DR5∷GUS云煙87轉基因純合株系。轉基因煙草材料的獲得以及pDR5∷GUS的構建參照Jia等[16]方法。

1.2 試驗設計

將飽滿均勻的煙草種子消毒后播種到培養皿中，將點好種子的培養皿置于28 ℃暗室中催芽3 d。將發芽后的煙草幼苗置于人工氣候培養箱培養2周，第1周使用1/4霍格蘭氏(Hoagland’s)營養液培養，第2周使用1/2營養液培養，每3 d更換一次營養液。選擇長勢一致的煙苗移至裝有石英砂的PVC塑料碗中，1/2 營養液緩苗3 d后，使用全營養液進行鎘處理21 d后，取樣檢測。人工培養箱培養條件為光強280 μmol·m-2·s-1，28 ℃/24 ℃(16 h晝/8 h夜)，相對濕度72%。以氯化鎘水合物(CdCl2·2.5H2O)作為鎘源。將CdCl2·2.5H2O用蒸餾水溶解，加入到Hoagland’s營養液中。鎘濃度分別設定為0(Cd0)、5(Cd5)、10 (Cd10)、20 (Cd20)、40 μmol·L-1(Cd40)。每個處理3次重復。

1.3 試驗方法

1.3.1煙草表型的記錄和側根數的測定 使用尼康D7000相機拍照，記錄不同鎘濃度下的煙草表型，人工測定二級根的數量。

1.3.2生物量測定 對煙草植株進行地上部和地下部采樣，用JA2003天平(上海儀分科學儀器有限公司)稱重，記錄樣品鮮重。

1.3.3GUS染色和NBT染色 將新鮮洗凈的煙苗整株浸沒于β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染液中，37 ℃恒溫培養箱中避光染色24 h后，用95%乙醇浸泡脫色。將新鮮的清洗干凈的煙苗浸沒于氮藍四唑(NBT)染液中， 30 ℃恒溫培養箱中避光染色5 h，使用95%乙醇脫色。用德國蔡司Stemi 508體式顯微鏡觀察，并拍照記錄。

1.3.4葉綠素含量和MDA含量的測定 葉綠素含量測定參照吳德慧[17]方法,丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定參照Feng等[18]方法。Cd含量測定參照張曉等[19]方法，使用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS 7500A，美國Agilent)測定鎘含量。將煙苗的地上部和地下部取樣，于-70 ℃冷凍保存。參照Jia等[20]方法測定煙株中生長素(IAA)含量。IAA標準品購自Sigma-Aldrich公司。

對新鮮煙苗整株取樣，根據GenBank發布的生長素相關基因的序列設計擴增引物，以NtL25為內參基因，由北京擎科新業生物技術有限公司合成，引物信息見表1。參照Jia等[20]方法進行qRT-PCR分析。每個樣品3次重復，實時定量的結果采用2-ΔΔCt方法[21]進行分析。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences

1.4 數據處理

采用Sigmplot 2018和DPS進行數據分析和整理。

2 結果分析

2.1 不同濃度鎘處理對煙苗表型和生物量的影響

5個不同濃度鎘處理下的煙苗表型見圖1。與對照Cd0相比，隨著供鎘水平的不斷提高，煙草幼苗逐漸矮化，主根變短，側根數減少，葉子發黃，葉片短小。煙苗鮮重和側根數結果(圖1)顯示， Cd5、Cd10、Cd20、Cd40處理的生物量(鮮重)分別較Cd0顯著減少11.1%、38.0%、45.8%、73.1%，而側根數分別較Cd0顯著減少26.7%、40%、53.3%、73.3%。結果表明，鎘濃度的不斷增加對煙苗產生了毒害作用，抑制了其正常的生長發育。

2.2 不同濃度鎘處理對煙苗鎘含量的影響

煙苗中鎘含量的測定結果(圖2)顯示，隨著供鎘水平不斷提高，煙苗中的鎘含量呈上升趨勢。與Cd5相比，Cd10、Cd20、Cd40處理中的鎘含量分別顯著增加84.8%、353.4%、681.7%。煙草對鎘的富集作用導致煙苗中鎘含量增加，40 μmol·L-1處理下鎘積累最多，表明該處理下鎘對煙苗的毒害作用更強，這與表型及生物量結果一致。

2.3 不同濃度鎘處理對煙苗葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用的重要物質，植物在逆境條件下葉綠體結構遭到破壞, 從而導致葉綠素含量下降，光合作用相關的酶失活或變性。由圖3可以看出，葉綠素含量隨供鎘水平的增加而降低，且均達到顯著差異水平。Cd20處理的葉綠素含量下降至Cd0的39.9%， Cd40處理下降為Cd0的24.5%，葉綠素大量降解。

2.4 不同濃度鎘處理對煙苗抗氧化能力的影響

2.5 不同濃度鎘處理對煙苗生長素分布和含量的影響

為了探究鎘處理是否對煙苗生長素合成或運輸產生影響，利用DR5∷GUS云煙87能夠標記生長素分布的特性[22]，對根尖部位進行染色，GUS染色的顏色深淺可以反應植物組織中生長素分布情況。染色結果(圖5)顯示，隨著鎘脅迫程度的加深，藍色逐漸變淺，在根尖聚集的生長素越來越少，維管束中的生長素也逐漸減少。不同處理的地上部和地下部生長素含量均顯著下降，Cd40處理的煙苗地上部和地下部生長素含量僅為Cd0的40.4%和15.5%。鎘處理可能抑制了煙苗中生長素的合成，以及生長素從形態學上端運輸到形態學下端的極性運輸。

2.6 不同濃度鎘處理對煙苗生長素相關基因表達的影響

煙苗中生長素合成限速酶NtYUCCA基因家族和生長素極性運輸蛋白基因家族NtPINs的基因表達結果(圖6)顯示，除NtYUCCA3、NtPIN3的表達水平變化不顯著外，生長素相關基因的相對表達量均隨著供鎘水平的上升而降低。與Cd0相比，Cd5、Cd10、Cd20、Cd40處理的生長素合成基因NtYUCCA4和NtYUCCA8的相對表達量均顯著降低，其中Cd40處理分別顯著下降60.1%和66.4%；NtYUCCA6和NtYUCCA9的相對表達量在Cd5處理有所下降，但差異不顯著，Cd40處理下分別顯著降低54.8%和70.2%；生長素極性運輸蛋白基因NtPIN1a、NtPIN1c、NtPIN4的相對表達量均顯著降低，Cd40處理分別下降70.8%、74.5%、58.5%；NtPIN9的相對表達量在Cd5和Cd10處理中分別下降1.5%和3.4%，但差異不顯著，在Cd20、Cd40處理中分別顯著降低33.1%和54.2%。結果表明，在鎘脅迫下生長素合成和極性運輸相關基因表達均受到抑制，且抑制作用隨著鎘濃度的增加而增強。

3 討論

本研究發現，隨著供鎘水平的增加，鎘會嚴重影響煙草幼苗的生長發育。在40 μmol·L-1的鎘濃度下，煙草幼苗生物量比對照減少73.1%，根系發育不正常，側根數下降73.3%。這與前人對煙草[23-24]及冬小麥[25]的研究結果一致。而賈月慧等[26]研究指出，50、100 mg·L-1的鎘對生菜生物量干質量和鮮質量均有顯著促進作用。這可能是因為不同作物對鎘的吸收與品種、pH、離子環境等有關，因而其有效濃度存在較大差異，但總體趨勢是高濃度鎘對作物生長表現出抑制作用。煙草屬于易富集鎘的作物[27]，本研究發現在40 μmol·L-1的鎘濃度下，煙苗鎘含量增加681.7%。