片仔癀通過抑制TLR4／MAPK 信號通路減輕LPS誘導的BV2 小膠質細胞神經炎癥損傷研究

黃貞偉，張 慶，黃莉莉，張小琴，黃鳴清

福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122

* 通信作者：張小琴，E-mail：2012030@fitcm.edu.cn；黃鳴清，E-mail：hmq1115@126.com

缺血性腦卒中是一種急性腦血管疾病，可導致偏癱，甚至死亡，影響人們生活質量，加重社會負擔［1］。小膠質細胞是中樞神經系統中一種固有的免疫細胞，在缺血性腦卒中發生、發展過程中過度活化的小膠質細胞引發神經炎癥反應，進而損傷腦組織［2］。Toll 受體4（TLR4）是Toll 樣受體家族中的一員，是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的關鍵受體之一，其在腦內主要分布于小膠質細胞，可參與炎癥相關信號通路的轉導［3］。 絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細胞外信號調節蛋白激酶（ERK1／2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK），可參與調節多種生理活動，與細胞炎癥反應密切相關［4］。 既往研究表明，TLR4／MAPK 信號通路在缺血性腦卒中引發以及LPS 誘導的小膠質細胞神經炎癥反應中均發揮重要作用［5-6］。

片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）是我國一種名貴中成藥，由麝香、牛黃、三七、蛇膽等名貴藥材精制而成，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛等功效。現代藥理研究也發現PZH 具有抗腫瘤、解熱抗炎和腦保護作用［7-8］。劉麗星等［9］發現PZH 可降低大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠腦內IL-6 等促炎因子的表達水平，減輕腦卒中后神經炎癥損傷。 本課題組前期研究也表明PZH可以抑制神經炎癥反應，減輕腦缺血再灌注損傷［10］。以上提示PZH 具有抑制神經炎癥反應的作用，但是PZH 是否通過TLR4／MAPK 信號通路改善小膠質細胞神經炎癥損傷未見報道，因此本實驗通過LPS建立BV2 小膠質細胞神經炎癥損傷模型對此進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑

PZH（漳州片仔癀藥業有限公司）；LPS、MTT（美國Sigma 公司）；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；RPMI-1640 完全培 養 基（美國Gibco 公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；ChamTM SYBR?qPCR Master Mix （南京Vazyme 公司）、逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司）；TLR4（美國SANTA CRUZ 公司）；iNOS（美國abcam 公司）；βactin、ERK1／2、p-ERK1／2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、COX-2 和兔二抗（美國CST 公司）。

1.2 主要儀器

電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；光學顯微鏡、細胞培養箱（美國Thermo Fisher 公司）；4 ℃離心機（德國Eppendorf 公司）；酶標儀（瑞士TECAN公司）；BIO-RAD 電泳儀、化學發光成像儀（美國BIO-RAD 公司）；7900H 熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）。

1.3 藥物制備

將PZH 研磨至粉末狀，稱取一定量粉末，溶于含20% DMSO 的磷酸緩沖鹽中，配制成濃度為25 mg／mL 的母液備用。

1.4 細胞培養

復蘇BV2 小膠質細胞（中國典型培養物保存中心），培養于RPMI-1640 完全培養基（含10% 胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，每天換液，隔天傳代，供后續實驗使用。

1.5 模型建立和分組

將處于對數生長期、狀態良好的BV2 小膠質細胞接種于96 孔板，然后置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中繼續培養12 h，再用LPS 刺激BV2小膠質細胞12 h，LPS 終濃度為100 ng／mL。實驗分組：正常對照組，LPS 模型組（100 ng／mL），PZH 低劑量組（0.05 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH中劑量組（0.10 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH高劑量組（0.15 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）。

1.6 MTT 法檢測BV2 小膠質細胞存活率

將BV2 小膠質細胞種于96 孔板，種板密度為5×104個／mL，每孔100 μL，設置6 個復孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱培養。 MTT 實驗分組：正常對照組，LPS 模型組（100 ng／mL），單獨PZH組（0.05 mg／mL、0.10 mg／mL、0.15 mg／mL），PZH 低劑量組（0.05 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH中劑量組（0.10 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH高劑量組（0.15 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）。 培養12 h 細胞后更換新的培養基，按照組別加入對應的PZH 和LPS，再將孔板放入37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱繼續培養12 h，然后取出96 孔板更換新的培養基，再加入MTT（5 mg／mL）10 μL，繼續培養4 h 后吸棄培養基，加入150 μL DMSO，置于搖床振蕩10 min，然后使用酶標儀測定490 nm 處吸光度（A 值），最后根據A 值計算細胞存活率。

1.7 顯微鏡下觀察BV2 小膠質細胞形態變化

將BV2 小膠質細胞接種于24 孔板，種板密度為5×104個／mL，每孔500 μL，設置3 個復孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱培育12 h 后更換新培養基，按照組別加入對應的PZH 和LPS，繼續培養12 h 后取出，置于顯微鏡下觀察各組細胞的形態并拍片。

1.8 ELISA 法檢測細胞上清中促炎因子IL-6 的水平

細胞種板、造模和給藥方法同“1.7”，然后收集細胞上清液，于4 ℃離心機離心（12 000 r／min）5 min，然后取上清。 按照ELISA 法測定說明書，依次加入樣品／標準品、生物素化抗體、親和素-過氧物酶復合物以及顯色液，最后加入終止液后于450 nm 處測定吸光度，根據標準曲線計算各樣品中IL-6 的含量。

1.9 RT-qPCR 法檢測BV2 小膠質細胞中促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 轉錄水平

將BV2 小膠質細胞接種于6 孔板，種板密度為1.6×105個／mL，每孔2 mL，設置3 個復孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱培育12 h 后更換新培養基，按照組別加入對應的PZH 和LPS，置于培養箱中繼續培養12 h 后棄上清，用預冷的PBS 洗滌3 遍后加入TRIzol 提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒制備cDNA，然后以該cDNA 為模板，使用擴增試劑盒進行擴增。 采用引物設計軟件Primer 5 設計促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 以及內參GAPDH 的引物序列。 PCR 擴增反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，退火60 ℃30 s，40 個循環。 相應引物序列見表1。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α 和GAPDH 基因引物序列Table 1 Primer sequences of IL-1β，IL-6，TNF-α and GAPDH genes

1.10 Western blot 法檢測BV2 小膠質細胞中炎性蛋白酶COX-2 和iNOS 的水平

細胞種板、造模和給藥同“1.9”，然后棄上清液，用預冷的PBS 洗滌3 遍后加入細胞裂解液提取總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，再加入5%加樣緩沖液，于100 ℃中煮10 min 制備蛋白樣品。 每組取40 μg 蛋白樣品，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白，再將蛋白轉至PVDF膜，然后置于脫脂奶粉（或BSA）中封閉1.5 h。 接著孵育一抗（COX-2、iNOS、β-actin）和相應二抗，再置于凝膠成像系統中顯影，最后使用Image Lab 軟件分析圖像。

1.11 Western blot 法檢測BV2 小膠質細胞中TLR4／MPAK 通路相關蛋白表達水平

蛋白樣品制備方法同“1.10”。 每組取40 μg 蛋白樣品，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白，再將蛋白轉至PVDF 膜，然后置于脫脂奶粉（或BSA）中封閉1.5 h。 然后依次孵育一抗（TLR4、ERK1／2、p-ERK1／2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、β-actin）和相應二抗，然后置于凝膠成像系統中顯影，最后使用Image Lab 軟件分析圖像。

1.12 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統計處理。 計量資料用（±s）表示，當數據滿足正態分布時，組間比較采用單因素方差分析，如果方差齊則采用LSD-t法，如果方差不齊則采用Games-Howell 法；當數據不滿足正態分布時，組間比較則采用非參數檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PZH 和LPS 對BV2 小膠質細胞活力的影響

采用MTT 法檢測LPS 和PZH 干預后BV2小膠質細胞的存活率。 與正常對照組比較，LPS（100 ng／mL）刺激BV2 小膠質細胞12 h 后，細胞存活率沒有發生明顯變化；當PZH（0.05、0.10、0.15 mg／mL）單獨作用或PZH 和LPS 同時刺激BV2 小膠質細胞12 h 時，細胞存活率仍然沒有明顯變化。 綜上表明，在本實驗條件下，LPS 和PZH 對BV2 小膠質細胞無明顯毒性作用。 見表2。

表2 PZH 和LPS 對BV2 小膠質細胞活力的影響（±s）Table 2 Effect of PZH and LPS on the viability of BV2 microglial cells （±s）

表2 PZH 和LPS 對BV2 小膠質細胞活力的影響（±s）Table 2 Effect of PZH and LPS on the viability of BV2 microglial cells （±s）

組別正常對照組LPS 模型組0.05 mg／mL PZH 組0.10 mg／mL PZH 組0.15 mg／mL PZH 組PZH 低劑量組（0.05 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）PZH 中劑量組（0.10 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）PZH 高劑量組（0.15 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）n66666666存活率／%100.00±4.40 102.97±9.89 95.52±15.71 101.07±8.73 107.47±7.55 106.47±4.74 100.24±4.20 103.94±8.38

2.2 PZH 對LPS 誘導后BV2 小膠質細胞形態的影響

顯微鏡下觀察發現，與正常對照組比較，BV2小膠質細胞在LPS 刺激12 h 后，細胞胞體變大，細胞突起增多變長，表明細胞被激活；而加入不同濃度PZH 干預后，BV2 小膠質細胞突起明顯減少，表明PZH 可抑制BV2 小膠質細胞的活化，見圖1。

圖1 PZH 對LPS 誘導的BV2 小膠質細胞形態的影響（×200）Figure 1 Effect of PZH on the morphology of LPS-induced BV2 microglial cells （×200）

2.3 PZH 對LPS 誘導后BV2 小膠質細胞促炎因子IL-6 表達的影響

采用ELISA 法檢測細胞上清中IL-6 的水平。與正常對照組比較，BV2 小膠質細胞在LPS 刺激12 h后，IL-6 表達水平明顯上升（P＜0.001）；與LPS 模型組比較，在給予不同濃度的PZH（0.05、0.10、0.15 mg／mL）共同干預12 h 后，IL-6 表達水平明顯下降（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。 見表3。

2.4 PZH 對LPS 誘導后BV2 小膠質細胞中促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平的影響

RT-qPCR 法檢測BV2 小膠質細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 轉錄水平。 與正常對照組比較，LPS 刺激12 h 后，BV2 小膠質細胞中IL-1β（P＜0.001）、IL-6（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01）的mRNA 水平明顯上升；與LPS 模型組比較，不同濃度的PZH 可明顯降低細胞中IL-1β（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）、IL-6（P＞0.05，P＜0.01，P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001）的mRNA 水平。 見表4。

表3 PZH 對BV2 小膠質細胞分泌IL-6 的影響（±s）Table 3 Effect of PZH on the IL-6 secretion of BV2 microglial cells （±s）

表3 PZH 對BV2 小膠質細胞分泌IL-6 的影響（±s）Table 3 Effect of PZH on the IL-6 secretion of BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.001；與LPS 模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01；與PZH 低劑量組比較，4） P＜0.05。Note: Compared with the normal control group, 1) P＜0.001;Compared with the LPS model group, 2) P＜0.05, 3)P＜0.01; Compared with the low-dose PZH group, 4)P＜0.05.

IL-6／（pg／mL）56.80±1.79 1 240.39±15.831）843.50±51.332）597.30±69.442）394.97±59.403）4）組別正常對照組LPS 模型組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333

表4 PZH 對LPS 誘導后BV2 小膠質細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平的影響（±s）Table 4 Effect of PZH on the mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

表4 PZH 對LPS 誘導后BV2 小膠質細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平的影響（±s）Table 4 Effect of PZH on the mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.001，2） P＜0.01；與LPS 模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01，5） P＜0.001；與PZH 低劑量組比較，6） P＜0.001。Note: Compared with the normal control group, 1) P＜0.001, 2) P＜0.01; Compared with the LPS model group, 3) P＜0.05, 4) P＜0.01, 5) P＜0.001; Compared with the low-dose PZH group, 6) P＜0.001.

TNF-α mRNA 1.00±0.20 7.61±1.592）2.71±0.474）2.39±0.994）0.88±0.095）組別正常對照組LPS 模 型 組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333 IL-1β mRNA 1.00±0.06 749.24±77.731）589.43±89.813）469.66±73.094）188.41±20.965）IL-6 mRNA 1.00±0.07 223.77±19.401）208.15±12.11 162.79±23.274）73.31±10.045）6）

2.5 PZH 對LPS 誘導后BV2 小膠質細胞中炎性蛋白酶COX-2 和iNOS 表達的影響

Western blot 法檢測BV2 小膠質細胞質中COX-2 和iNOS 蛋白表達水平。 與正常對照組比較，LPS刺激12 h 后，BV2 小膠質細胞中COX-2 和iNOS 蛋白水平均明顯增加（P＜0.001，P＜0.001）；與LPS 模型組比較，不同濃度PZH（0.05、0.10 和0.15 mg／mL）共同干預12 h 時，PZH 可明顯降低細胞中COX-2蛋白表達水平（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001）以及iNOS 蛋白表達水平（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），見表5 和圖2。

表5 PZH 對LPS 誘導的BV2 小膠質細胞中COX-2 和iNOS 蛋白表達的影響（±s）Table 5 Effect of PZH on the protein expression of COX-2 and iNOS in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

表5 PZH 對LPS 誘導的BV2 小膠質細胞中COX-2 和iNOS 蛋白表達的影響（±s）Table 5 Effect of PZH on the protein expression of COX-2 and iNOS in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.001；與LPS 模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.001；與PZH 低劑量組比較，4） P＜0.05，5） P＜0.01。Note: Compared with the normal control group, 1) P＜0.001;Compared with the LPS model group, 2) P＜0.01, 3)P＜0.001; Compared with the low-dose PZH group, 4)P＜0.05, 5) P＜0.01.

iNOS 蛋白1.00±0.00 2.28±0.411）1.47±0.292）1.17±0.242）1.12±0.062）組別正常對照組LPS 模型組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333 COX-2 蛋白1.00±0.00 4.23±0.251）3.01±0.152）2.33±0.172）4）1.13±0.223）5）

圖2 PZH 對LPS 誘導的BV2 小膠質細胞中COX-2和iNOS 蛋白表達的影響Figure 2 Effect of PZH on the protein expression of COX-2 and iNOS in LPS-induced BV2 microglial cells

2.6 PZH 對LPS 誘導后BV2 小膠質細胞TLR4／MAPK 信號通路的影響

Western blot 法檢測BV2 小膠質細胞中TLR4／MAPK 信號通路相關蛋白的表達水平。 與正常對照組比較，LPS 刺激12 h 后，BV2 小膠質細胞中TLR4（P＜0.05）、p-ERK1／2（P＜0.01）、p-p38（P＜0.01）表達水平明顯上升；與LPS 模型組比較，不同濃度的PZH 可抑制TLR4（P＞0.05，P＜0.05，P＜0.05）、p-ERK1／2（P＞0.05，P＜0.05，P＜0.01）、p-p38（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）蛋白表達。 LPS 刺激后BV2小膠質細胞中p-JNK 有一定上升，但差異無統計學意義（P＞0.05），PZH 對p-JNK 蛋白表達則無明顯影響。 見表6 和圖3。

表6 PZH 對LPS 誘導的BV2 小膠質細胞中TLR4／MAPK 信號通路相關蛋白表達的影響（±s）Table 6 Effect of PZH on the protein expression of TLR4／MAPK signal pathway-related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

表6 PZH 對LPS 誘導的BV2 小膠質細胞中TLR4／MAPK 信號通路相關蛋白表達的影響（±s）Table 6 Effect of PZH on the protein expression of TLR4／MAPK signal pathway-related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與LPS 模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal control group,1)P＜0.05,2)P＜0.01;Compared with the LPS model group,3)P＜0.05,4)P＜0.01.

p-p38 蛋白1.00±0.00 2.09±0.282）1.32±0.363）0.99±0.284）0.81±0.264）組別正常對照組LPS 模型組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333 TLR4 蛋白1.00±0.00 1.55±0.071）1.37±0.24 1.16±0.203）1.09±0.233）p-ERK1／2 蛋白1.00±0.00 2.10±0.072）1.44±0.24 1.00±0.033）0.88±0.044）p-JNK 蛋白1.00±0.00 1.24±0.17 1.25±0.11 1.13±0.05 1.25±0.11

圖3 PZH 對LPS 誘導的BV2 小膠質細胞中TLR4／MAPK 信號通路相關蛋白表達的影響Figure 3 Effect of PZH on the protein expression of TLR4／MAPK signaling pathway-related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells

3 討 論

神經炎癥反應是缺血性腦卒中發生、發展過程中一個非常重要的分子機制，參與腦缺血再灌注損傷，造成腦內組織壞死、水腫，最終導致機體多重功能損傷。 小膠質細胞是腦內的巨噬細胞，約占大腦膠質細胞的10%～20%，正常情況下激活的小膠質細胞具有維持腦內穩態和促進神經系統損傷修復的重要生理作用，但是在缺血性腦卒中發生后過度活化的小膠質細胞會釋放促炎因子和炎性蛋白酶，如IL-6、COX-2 和iNOS 等，參與神經炎癥反應并損傷周圍神經元。 而且，損傷的神經元細胞會釋放出毒性物質再次刺激小膠質細胞，進一步加重神經炎癥反應［11-12］。因此，抑制小膠質細胞引發的神經炎癥反應，可減輕神經炎癥造成的損傷，且有益于神經系統損傷的修復，這在缺血性腦卒中的治療及康復過程中具有重要的意義。

IL-1β、IL-6 和TNF-α 是小膠質細胞神經炎癥損傷過程中重要的炎癥因子，參與炎癥信號網絡的啟動和放大以及炎癥反應損傷，其表達水平代表神經炎癥反應損傷的程度［13］。 本實驗結果顯示，經過LPS 刺 激 后，BV2 小 膠 質 細 胞 中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平明顯上升，促炎因子IL-6 分泌大量增加；PZH 干預后，BV2 小膠質細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平明顯下降，抑制LPS 誘導的BV2 小膠質細胞分泌IL-6。 COX-2 是將花生四烯酸轉化成前列腺素的一種限速酶，后者在參與調控慢性和急性炎癥中扮演重要角色［14］。 iNOS 是NO 合成的關鍵酶，炎癥反應發生后iNOS 高表達，進而促進合成大量的NO 以參與炎癥反應，可導致自由基形成、血腦屏障通透性增加，進而加重腦損傷［15］。本實驗結果顯示，在LPS 刺激后，BV2 小膠質細胞高表達COX-2 和iNOS 蛋白，PZH 干預可以顯著抑制LPS 誘導的BV2 小膠質細胞表達COX-2 和iN OS。 總之，結果表明PZH 可抑制LPS 誘導的BV2小膠質細胞神經炎癥反應。

為了闡明PZH 抑制LPS 誘導的BV2 小膠質細胞中IL-6、COX-2 和iNOS 表達的機制，本研究進一步探究了PZH 對信號通路TLR4／MAPK 的影響。研究發現，LPS 與小膠質細胞膜上的TLR4 受體相結合后可促進TLR4 高表達，并且在髓樣分化因子（MyD88）的作用下激活MAPKs（ERK1／2、JNK 和p38 MAPK）信號通路，而MAPKs 信號通路在調節免疫反應和炎癥應答中扮演重要角色，與IL-6、iNOS 和COX-2 等一系列促炎因子和炎性蛋白酶的大量合成釋放密切相關［16］。本實驗結果顯示，在LPS刺激BV2 小膠質細胞后，TLR4 表達增加，且磷酸化MAPKs 水平升高，即TLR4／MAPK 信號通路被激活。 PZH 的干預則可明顯降低LPS 誘導的BV2 小膠質細胞TLR4 的表達，并且抑制MAPKs 磷酸化，即降低了p-ERK1／2 和p-p38 蛋白的表達水平，但是PZH 對p-JNK 蛋白的表達無明顯影響，結果提示PZH 可抑制LPS 誘導的TLR4／MAPK 信號通路的激活。

綜上所述，PZH 可能是通過抑制TLR4／MAPK信號通路，進而抑制炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNFα 轉錄，降低促炎因子IL-6 以及促炎性蛋白酶COX-2、iNOS 的表達，發揮其改善LPS 誘導BV2 小膠質細胞神經炎癥損傷的作用。 本實驗為進一步研究PZH 治療腦卒中的機制以及其臨床應用提供依據和實驗基礎。