蘋果蠹蛾瞬時(shí)感受器離子通道基因的克隆及溫度脅迫表達(dá)分析

梁林 呂志創(chuàng) 武強(qiáng) 劉懷 劉萬學(xué) 萬方浩

摘要 ：瞬時(shí)感受器離子通道（transient receptor potential， TRP）是影響昆蟲溫度感知系統(tǒng)的關(guān)鍵組成。為探討蘋果蠹蛾溫度感知和溫度適應(yīng)的機(jī)理，本研究以蘋果蠹蛾Cydia pomonella為研究對(duì)象，通過分子克隆獲得TRPA家族中的CpPainless和CpWater_witch基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析靶基因在高低溫脅迫后的表達(dá)。結(jié)果表明，CpPainless基因編碼938個(gè)氨基酸，N端有8個(gè)錨蛋白重復(fù)序列。CpWater_witch基因編碼980個(gè)氨基酸，N端有10個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，二者編碼產(chǎn)物均有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，具瞬時(shí)感受器離子通道家族成員結(jié)構(gòu)典型特征。表達(dá)分析結(jié)果顯示，和對(duì)照26℃相比，高低溫脅迫1 h后，CpPainless在5齡幼蟲雌蟲體內(nèi)的表達(dá)量顯著下調(diào)，而5齡幼蟲雄蟲經(jīng)低溫脅迫1 h后CpPainless表達(dá)量顯著上調(diào)，但高溫脅迫1 h后表達(dá)差異不顯著;CpWater_witch在雌雄蟲體內(nèi)均沒有顯著變化。研究結(jié)果為研究瞬時(shí)感受器離子通道在蘋果蠹蛾溫度感知中的作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ：蘋果蠹蛾; 瞬時(shí)感受器離子通道; 溫度感知; 溫度脅迫; 表達(dá)量

中圖分類號(hào)： S 436.611.29

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019564

Cloning and expression analysis of transient receptor potential gene in Cydia pomonella under temperature stress

LIANG Lin1，2， L Zhichuang2， WU Qiang2， LIU Huai1， LIU Wanxue2， WAN Fanghao2*

（1. College of Plant Protection， Southwest University， Chongqing 400715， China; 2. State Key

Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract ：TRP （transient receptor potential） is a key component of the temperature sensing system in insects. To understand the mechanism of temperature perception and temperature adaptation in Cydia pomonella， CpPainless and CpWater_witch， which belong to TRPA subfamily， were cloned by RTPCR （reverse transcription PCR）. After conducting bioinformatics analysis， quantitative realtime PCR was applied to characterize the relative expression levels of two genes at different temperature stresses. CpPainless and CpWater_witch were successfully predicted and cloned， which encoded 938 amino acids and 980 amino acids， respectively. Protein structure analysis indicated that CpPainless and CpWater_witch had 8 ankyrin repeats and 10 ankyrin repeats， respectively. Both of the genes had 6 transmembrane domains， which is the structural signature of TRP. The RTPCR analysis showed that the expression level of CpPainless was significantly decreased in female 5thinstar larvae 1 h after temperature stress， but significantly increased in male 5thinstar larvae 1 h after lowtemperature stress， whereas there was no significant difference in male larvae 1 h after hightemperature stress; besides， CpWater_witch did not show significant difference in both male and female 5thinstar larvae after temperature stress. The results laid a foundation for further understanding of the role of transient receptor channels in temperature perception of C.pomonella.

Key words ：Cydia pomonella; TRP channel; temperature sensing; temperature stress; expression

蘋果蠹蛾Cydia pomonella （L.）屬鱗翅目Lepidoptera小卷蛾科Olethreutidae，是最重要的世界性檢疫性害蟲之一，其以幼蟲蛀食果實(shí)為害，嚴(yán)重降低果實(shí)品質(zhì)[1]，并導(dǎo)致果實(shí)成熟前腐爛和脫落[2]，給世界各地蘋果、沙果、梨、桃、杏、石榴等水果的生產(chǎn)帶來了毀滅性危害[3]。蘋果蠹蛾原產(chǎn)于歐亞大陸南部，現(xiàn)已廣泛分布于除南極洲外其他各大洲的各大蘋果產(chǎn)區(qū)[4]。在我國，蘋果蠹蛾也具有廣泛的適生區(qū)域，其中中高度適生區(qū)主要包括黑龍江、內(nèi)蒙古、北京、新疆等省（市、自治區(qū)）的大部分地區(qū)，以及遼寧西部、青海北部、云南北部、及山東沿海等地區(qū)[6]，而最佳適生區(qū)幾乎包括了我國蘋果、梨等水果的全部主產(chǎn)區(qū)[7]，提示其具有廣泛的溫度適應(yīng)性。為更好地理解蘋果蠹蛾溫度適應(yīng)能力，研究蘋果蠹蛾怎樣感知外界溫度并將其傳遞至體內(nèi)具有重要意義。

瞬時(shí)感受器離子通道（transient receptor potential， TRP）是一種陽離子通道，可允許包括鈣離子在內(nèi)的陽離子進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，最早發(fā)現(xiàn)于黑腹果蠅Drosophila melanogaster視覺信號(hào)通路[8]。之后發(fā)現(xiàn)TRP通道是多種感覺機(jī)制中的關(guān)鍵因子，如視覺、聽覺、化學(xué)感受、機(jī)械感受和溫度感受[9]。1989年Montell等[10]成功克隆了TRP基因。迄今為止，在生物中已鑒定出30多個(gè)TRP通道[11]，經(jīng)研究，TRP蛋白包含6個(gè)跨膜域結(jié)構(gòu)（S1～S6）[12]。根據(jù)基因的功能及同源性，可將TRP基因家族分為7個(gè)主要亞家族[13]：TRPC（canonical）、TRPV（vanilloid）、TRPM（melastatin）、TRPML（mucolipin）、TRPP（polycystin）、TRPA（ankyrin transmembrane protein）和 TRPN（NomPClike）。對(duì)溫度敏感且參與生物體環(huán)境溫度感知的TRP，稱為thermoTRP[14]。

ThermoTRP 的活性與溫度密切相關(guān)[15]。果蠅體內(nèi)已鑒定出13個(gè)TRP通道[9]，有6個(gè)thermoTRP[16]，其中TRPA1、Painless、Pyrexia均屬于TRPA亞家族。研究表明，果蠅體內(nèi)的painless基因是傷害性高溫激活其感覺神經(jīng)過程中所必需的[17]。此外，膜翅目昆蟲中同樣屬于TRPA亞家族的Water_witch，在復(fù)制過程中形成的HsTRPA也參與了溫度感知[18]。因此，本文選取TRPA亞家族中的painless和Water_witch兩個(gè)基因，對(duì)其在蘋果蠹蛾體內(nèi)是否參與溫度感知過程進(jìn)行探討。

本研究克隆了蘋果蠹蛾中的2個(gè)TRP通道基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)和溫度脅迫下靶基因表達(dá)的分析，以期為其在蘋果蠹蛾溫度調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

蘋果蠹蛾以人工飼料飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所P2實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 總RNA提取及第一鏈cDNA的合成

取一頭5齡幼蟲，采用TRIzol（Invitrogen，USA），參照其說明書進(jìn)行RNA提取，采用Implen超微量紫外可見分光光度計(jì)（NanoPhotometerTM PClass）和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度和完整度。采用Super Script FirstStrand Synthesis System試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TRP基因cDNA序列片段的克隆

通過生物信息學(xué)的方法，分別以黑腹果蠅 TRPA亞家族中Painless 和Water_witch兩個(gè)基因序列作為參考序列，用tBlastn從蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索CpPainless 和CpWater_witch的基因序列，之后根據(jù)檢索結(jié)果，使用Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，使用RTPCR（reverse transcriptionpolymerase chain reaction） 方法從蘋果蠹蛾cDNA 中克隆CpPainless 和CpWater_witch的序列。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10× PCR buffer，0.5 μL dNTPs，上下游引物各1 μL，0.5 μL TransStart Taq DNA聚合酶，19 μL ddH2O，0.5 μL cDNA模板。反應(yīng)條件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min 10 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后，與TransGen pEASYT1 Cloning Vector連接，轉(zhuǎn)化至Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞中，接種至含Ampicillin、Xgal 和IPTG 的LB 固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h。挑取白色單菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)10 h，選出重組克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 蘋果蠹蛾TRP基因生物信息學(xué)分析

1.4.1 TRP基因cDNA序列分析

應(yīng)用MEGA 5軟件對(duì)預(yù)測序列與克隆序列進(jìn)行比對(duì)，確定克隆序列與預(yù)測序列一致后，采用DNAMAN軟件對(duì)所得基因cDNA序列進(jìn)行分析;利用ORF Finder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 工具鑒定cDNA的開放閱讀框;使用在線工具SMART（simple modular architecture research tool）對(duì)克隆得到的CpPainless和CpWater_witch進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，分析其序列N 端的錨蛋白重復(fù)序列及跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.4.2 TRP基因系統(tǒng)發(fā)育分析

檢索GenBank等數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道同源TRP基因序列，并采用MEGA 5軟件，選用鄰接法重復(fù)1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹構(gòu)建所用序列的序列號(hào)見表2。

1.5 蘋果蠹蛾TRP基因表達(dá)分析

研究表明，5齡為最耐熱的幼蟲階段[5]，因此本研究選取5齡幼蟲作為試驗(yàn)材料，分別對(duì)5齡幼蟲的雌、雄蟲進(jìn)行0、10、35、40℃脅迫1 h，以常溫（26℃）飼養(yǎng)品系作為對(duì)照。將試蟲迅速置于液氮致死，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA獲得cDNA，稀釋10倍備用。根據(jù)測序正確的CpPainless和CpWater_witch序列，分別設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，選用tub[1]作為內(nèi)參基因，引物序列見表3。

qRTPCR 反應(yīng)采用ABI 7500 realtime PCR system（Applied Biosystems， USA）進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL，包括1.0 μL 的cDNA 模板，10.0 μL 的Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox），1.0 μL 上游引物（10 μmol/L），1.0 μL 下游引物（10 μmol/L），DEPC水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min;

95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。所有樣品均為3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[19]。realtime PCR結(jié)果通過相對(duì)定量Ct閾值方法進(jìn)行相對(duì)定量分析[20]，不同溫度處理下CpPainless和CpWater_witch相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性應(yīng)用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析（Oneway ANOVA）法進(jìn)行分析。顯著性測定采用Tukeys HSD法，顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果蠹蛾CpPainless基因序列及結(jié)構(gòu)分析

利用從蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組預(yù)測的CpPainless序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（CpPainless F和CpPaninless R），通過PCR擴(kuò)增得到約為3 100 bp的特異性條帶，對(duì)擴(kuò)增條帶回收測序后，將測序結(jié)果與預(yù)測序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)所得片段為蘋果蠹蛾CpPainless基因的cDNA序列。使用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，序列的開放閱讀框長2 817 bp，編碼938個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測分子量大小為106.5 kDa，且存在8處AATAA（A）加尾信號(hào)。

將蘋果蠹蛾CpPainless基因蛋白質(zhì)序列提交至NCBI的SMART數(shù)據(jù)庫，結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，推導(dǎo)的氨基酸序列具有8個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（圖2），在線工具TMpred預(yù)測蘋果蠹蛾CpPainless基因具有6個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域，具備TRP家族基因的典型特征。

2.2 蘋果蠹蛾CpWater_witch基因序列及結(jié)構(gòu)分析

利用從蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組預(yù)測的CpWater_witch序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（CpWater_witch F和CpWater_witch R），通過PCR擴(kuò)增得到約為3 000 bp的特異性條帶，對(duì)擴(kuò)增條帶回收測序后，將測序結(jié)果與預(yù)測序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)所得片段為蘋果蠹蛾CpWater_witch基因的cDNA序列。使用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，序列的開放閱讀框長2 943 bp，編碼980個(gè)氨基酸（圖3），預(yù)測分子量大小為109.8 kDa，且存在3處AATAA（A）加尾信號(hào)。

將蘋果蠹蛾CpWater_witch基因蛋白質(zhì)序列提交至NCBI的SMART數(shù)據(jù)庫，結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，推導(dǎo)的氨基酸序列具有10個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（圖4），在線工具TMpred預(yù)測蘋果蠹蛾CpWater_witch基因具有6個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域，具備TRP家族基因的典型特征。

為研究蘋果蠹蛾P(guān)ainless和Water_witch與其他昆蟲TRP家族成員的進(jìn)化關(guān)系，選取果蠅、岡比亞按蚊、意大利蜜蜂、家蠶、赤擬谷盜這5種已經(jīng)完成基因組測序的昆蟲的TRP序列構(gòu)建進(jìn)化樹。通過昆蟲TRP進(jìn)化樹分析，TRP超家族在昆蟲中各家族成員之間分支清晰，進(jìn)化關(guān)系保守。由進(jìn)化樹可見，蘋果蠹蛾CpPainless基因與已知昆蟲的painless聚為一支，CpWater_witch基因與已知昆蟲的Water_witch聚為一支，且二者均歸結(jié)到TRPA亞家族所在的簇。（圖5）

2.3 蘋果蠹蛾CpPainless和CpWater_witch基因表達(dá)分析

對(duì)CpPainless的定量結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高低溫脅迫1 h后，5齡雌蟲體內(nèi)的CpPainless表達(dá)量均顯著下調(diào)，而5齡雄蟲經(jīng)高溫脅迫1 h后體內(nèi)的CpPainless表達(dá)量無顯著變化，低溫脅迫1 h后CpPainless表達(dá)量均顯著上調(diào)（圖6）。

對(duì)CpWater_witch的定量結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，高低溫脅迫1 h后，5齡幼蟲體內(nèi)CpWater_witch的表達(dá)量均無顯著性變化（圖7）。

3 結(jié)論與討論

從蘋果蠹蛾中克隆得到瞬時(shí)感受器離子通道CpPainless和CpWater_witch基因，并對(duì)其在昆蟲TRP中的進(jìn)化地位進(jìn)行分析，結(jié)果表明CpPainless和CpWater_witch屬于昆蟲TRPA亞家族成員;通過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，高低溫脅迫1 h后，CpPainless在5齡幼蟲雌蟲體內(nèi)的表達(dá)量顯著下調(diào)，雄蟲經(jīng)低溫脅迫1 h后，CpPainless表達(dá)顯著上調(diào)，但高溫脅迫1 h后表達(dá)差異不顯著;而CpWater_witch在雌雄蟲體內(nèi)表達(dá)均沒有顯著變化。

TRP基因家族因參與調(diào)控生物體對(duì)外界多種刺激的感知而受到廣泛關(guān)注[21]，研究表明，其在昆蟲感知溫度刺激的過程中起到重要作用[22]。在對(duì)TRPA亞家族成員的基序比較中發(fā)現(xiàn)，N端大量串聯(lián)的錨蛋白重復(fù)序列是TRPA亞家族的一項(xiàng)重要特征。有研究提出，N端錨蛋白重復(fù)序列有可能是感知并傳遞熱刺激的重要組成部分[2324]。本研究得到的CpPainless聚類到TRPA亞家族Painless一簇，且N端具有8個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，與果蠅的經(jīng)典Painless結(jié)構(gòu)較為相似;此外，作為果蠅中鑒定出來的第1個(gè)thermoTRP，DmelPainless被認(rèn)為是熱傷害受體，能夠感知高溫傷害性熱刺激，且該離子通道在果蠅體內(nèi)能被39～42℃的高溫激活，這在昆蟲感知疼痛從而逃避熱傷害的行為過程中起重要作用。綜上，推測painless很有可能在蘋果蠹蛾體內(nèi)參與熱傷害感受。此外，從本研究CpWater_witch的表達(dá)分析結(jié)果，推測該基因未直接參與蘋果蠹蛾溫度感知過程。

本研究對(duì)蘋果蠹蛾TRP在溫度響應(yīng)方面的探討，有助于我們進(jìn)一步研究其溫度適應(yīng)機(jī)制，從而為生態(tài)防控蘋果蠹蛾提供新思路。后續(xù)也將利用RNAi、電生理等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行基因功能研究，以揭示瞬時(shí)感受器離子通道在蘋果蠹蛾溫度適應(yīng)中的作用。

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（責(zé)任編輯：田 喆）