重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在人偏肺病毒快速診斷的方法建立與臨床評(píng)價(jià)*

唐 娟 劉文毅 劉 霄

廣東省深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院檢驗(yàn)科中心實(shí)驗(yàn)室 518105

在臨床上，急性呼吸道感染是目前國內(nèi)外導(dǎo)致急性病以及致死性疾病的重要病因之一，傳統(tǒng)的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、流感病毒和腺病毒等，但仍有1/3的感染病原尚未完全明確[1-2]。人偏肺病毒(hMPV)最早是由荷蘭學(xué)者Van De Hoogen等人在2001年從呼吸道感染嬰幼兒的標(biāo)本中分離獲取，且近年來在全球范圍內(nèi)多個(gè)國家均有陸續(xù)報(bào)道，提示了其呈全球流行，可能是社區(qū)獲得性呼吸道感染較為常見的一種病原體[3-4]。相關(guān)研究報(bào)道顯示，hMPV感染會(huì)導(dǎo)致上呼吸道或(和)下呼吸道感染，患者主要臨床表現(xiàn)包括咳嗽、咳痰、喘息、流涕、頭痛、乏力和發(fā)熱等，部分患者出現(xiàn)低氧血癥[5-6]。然而，hMPV感染患者尚且缺乏明顯的特異性臨床表現(xiàn)，難以依靠臨床癥狀與其他呼吸道病毒感染進(jìn)行鑒別區(qū)分，從而增加了臨床診斷的難度以及病毒傳播的速度。由此可見，建立病原體核酸快速診斷平臺(tái)顯得尤為重要，亦是目前國內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)亟待解決的問題之一。病毒核酸檢測(cè)的本質(zhì)是對(duì)病毒RNA基因組進(jìn)行檢測(cè)，如RT-PCR、基因芯片、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、核酸質(zhì)譜技術(shù)以及病毒基因組測(cè)序等[7]。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)屬于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)之一，即在固定的溫度條件下即可實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增，反應(yīng)過程無需溫控循環(huán)系統(tǒng)，整個(gè)過程在10～30min內(nèi)即可完成[8]。鑒于此，本文通過研究重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在hMPV快速診斷的方法建立與臨床價(jià)值，旨在為hMPV的診治提供一種科學(xué)的檢測(cè)手段，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2017年1月—2019年12月醫(yī)院收治的急性呼吸道感染患兒200例納入研究。年齡1～10歲，平均年齡(5.22±1.30)歲；男121例，女79例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)均因急性呼吸道感染入院接受治療；(2)入院前尚未接受任何相關(guān)治療；(3)無臨床病歷資料缺失。剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎等重要臟器發(fā)生嚴(yán)重病變者；(2)研究過程中因各種原因退出或失訪者；(3)正參與其他研究者。研究對(duì)象父母均簽署知情同意書，且本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 (1)重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)快速診斷hMPV的方法建立：團(tuán)隊(duì)前期通過檢索Genbank數(shù)據(jù)庫，檢索hMPV株基因序列，數(shù)據(jù)庫已公布了hMPV檢測(cè)用相關(guān)基因位點(diǎn)、引物及探針等序列信息和文獻(xiàn)報(bào)道的信息，針對(duì)靶向特定區(qū)域設(shè)計(jì)出引物和熒光探針，并進(jìn)一步在線BLAST比對(duì)驗(yàn)證，沒有在其他病毒中發(fā)現(xiàn)此靶向區(qū)域。隨后通過使用病毒株(逆轉(zhuǎn)錄病毒和噬菌體的生物學(xué)特性開發(fā)出模擬原病毒的假病毒或質(zhì)粒)和臨床不同類型陰性標(biāo)本對(duì)此方法學(xué)的最低檢測(cè)限、包容性、分析特異性和精密度進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，并驗(yàn)證其對(duì)臨床不同類型樣本在使用化學(xué)釋放法制備所引進(jìn)物質(zhì)的干擾試驗(yàn)。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件通過靶向特定區(qū)域，對(duì)hMPV的N基因和L基因2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)計(jì)引物及熒光探針。使用病毒株和陰性對(duì)照品對(duì)基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)hMPV的方法進(jìn)行性能評(píng)估。進(jìn)一步驗(yàn)證并優(yōu)化臨床不同類型樣本微量核酸釋放法聯(lián)合重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方案。(2)直接熒光免疫法檢測(cè)：具體操作嚴(yán)格參照參考文獻(xiàn)[9]：即由護(hù)士采集鼻咽分泌物，負(fù)壓吸取1～2ml的分泌物至無菌的生理鹽水溶液吸瓶內(nèi)，無痰者則在霧化后吸引，待標(biāo)本采集成功后于2h內(nèi)送檢。首先以毛細(xì)吸管對(duì)標(biāo)本進(jìn)行反復(fù)吹打，移至尖底離心管中以1 000～1 500r/min條件進(jìn)行時(shí)長5～10min的離心處理，去除上清液，留沉淀。加入5ml的PBS溶液進(jìn)行洗滌，劇烈混勻10～15s，再次按照上述離心條件進(jìn)行離心處理，將上清液和沉淀上的黏液層去除，避免攪亂細(xì)胞沉淀，重復(fù)洗滌5次左右，直至沉淀上的黏液層徹底除去，最后留取0.5～1ml的細(xì)胞懸液，于樣片上點(diǎn)樣，每點(diǎn)加入25μl的細(xì)胞懸液，待其自然干燥后，以冷丙酮進(jìn)行時(shí)長為10min的固定處理，風(fēng)干。隨后選擇樣本片或?qū)φ掌拿總€(gè)細(xì)胞點(diǎn)加入相應(yīng)的熒光抗體，在37℃溫盒中孵育30min，以洗滌液洗滌后加入1滴封閉液，封片后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。診斷陽性標(biāo)準(zhǔn)如下：熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)蘋果綠色熒光，且200倍顯微鏡下任一視野找到2個(gè)及2個(gè)以上熒光細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩種檢測(cè)方式的診斷效能，分析hMPV感染患者合并其他病毒感染情況。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方式的診斷效能評(píng)價(jià) 以RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)診斷hMPV的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為97.56%、98.74%、98.50%，均明顯高于直接熒光免疫法檢測(cè)的85.37%、93.71%、92.00%(均P<0.05)。見表1～2。

表1 兩種檢測(cè)方式的診斷結(jié)果評(píng)價(jià)

表2 兩種檢測(cè)方式的診斷靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)(%)

2.2 hMPV感染患者合并其他病毒感染情況分析 hMPV感染患者合并其他病毒感染發(fā)生率為26.83%，其中主要涵蓋冠狀病毒9.76%、呼吸道合胞病毒7.32%、流感病毒4.88%等。見表3。

表3 41例hMPV感染患者合并其他病毒感染情況分析

3 討論

在臨床上，hMPV的流行病學(xué)包括以下幾點(diǎn)特征[10-12]：(1)明顯的季節(jié)性，即多發(fā)于冬春季節(jié)；(2)可感染不同年齡階段人群，且以5歲以下兒童以及老年人群為主；(3)hMPV病毒可單獨(dú)感染易感人群，亦可和其他呼吸道病毒發(fā)生混合感染；(4)hMPV已遍布全球。隨著近年來相關(guān)研究的日益深入，不少學(xué)者提出對(duì)所有年齡階段的呼吸道疾病患者實(shí)施hMPV病毒檢測(cè)，從而抑制病毒的傳播速度[13-14]。然而，因國家藥品監(jiān)督管理局體外診斷試劑目錄尚無hMPV核酸檢測(cè)試劑盒，從而使得臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)無法開展hMPV核酸檢測(cè)服務(wù)，僅有少數(shù)的科研機(jī)構(gòu)可開展相關(guān)檢測(cè)服務(wù)，特別是在新型冠狀病毒防控時(shí)期，對(duì)急性傳染病病原學(xué)鑒別診斷造成了一定的難度，因此，尋找一種積極有效的病原體核酸快速診斷方式具有極其重要的意義。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)是近年來所開發(fā)的一種有望替代PCR的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其主要基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增原理，體外模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，于恒溫條件下即可對(duì)目的片段實(shí)施擴(kuò)增，尤其適用于多種病原的快速檢測(cè)中[15-17]。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)主要依賴可結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白以及鏈置換DNA酶，上述三種酶的混合物于常溫狀態(tài)下亦有一定活性，且最佳反應(yīng)溫度為37℃左右，反應(yīng)過程中無需模板鏈的預(yù)變性，可在恒定低溫條件下10～20min內(nèi)快速擴(kuò)增目的DNA或RNA[18-19]。相較于傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而言，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)具有反應(yīng)溫度恒定、擴(kuò)增速度快、檢測(cè)成本低、使用儀器簡單以及結(jié)果可靠等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，對(duì)急需診斷結(jié)果的患者而言意義十分重大。本研究發(fā)現(xiàn)，以RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)診斷hMPV的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均明顯高于直接熒光免疫法檢測(cè)。分析原因，筆者認(rèn)為重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)對(duì)檢測(cè)設(shè)備的要求較低，甚至可通過人體體溫完成對(duì)樣品的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)檢測(cè)樣品要求較低，僅需采用簡單的裂解液裂解60s便可作為模板，尤其適用于實(shí)地檢測(cè)。與此同時(shí)，該技術(shù)的特異性較佳，且靈敏度較高，可和RT-PCR相媲美。臨床體會(huì)，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)除了靈敏度、特異度較高以及適用于現(xiàn)場(chǎng)樣品檢測(cè)后，還具備以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：(1)可實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)，同時(shí)并快速地檢測(cè)多重樣品；(2)反應(yīng)速度迅速，往往在5～20min內(nèi)便可完成檢測(cè)，在速度方面展現(xiàn)出來的優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于PCR以及HDA等技術(shù)；(3)操作簡便，且能和多種檢測(cè)方式相結(jié)合，繼而提高臨床診斷價(jià)值；(4)檢測(cè)過程中有效減少所需能力以及成本，利于推廣應(yīng)用。然而，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)仍存在一定的不足之處：如相關(guān)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)過程中，必須對(duì)產(chǎn)物實(shí)施純化，從而避免產(chǎn)物之外的其他成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響；反應(yīng)溫度在37℃左右，且反應(yīng)時(shí)間較短，在對(duì)大量樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)過程中，不易控制反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行；迄今為止尚無專門的軟件對(duì)重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)引物以及探針實(shí)施設(shè)計(jì)和篩選。另外，hMPV感染患者合并其他病毒感染發(fā)生率為26.83%，這提示了部分hMPV感染患者往往合并其他病毒感染，從而可能增加臨床治療難度，應(yīng)予以重視。然而，蔡勇等人的一項(xiàng)研究報(bào)道表明[20]：223例hMPV陽性患兒同時(shí)檢出其他病毒感染人數(shù)42例，占比18.83%，明顯低于本研究結(jié)果。而導(dǎo)致兩項(xiàng)研究發(fā)生差異的主要原因可能和研究樣本量以及年齡階段不同有關(guān)，值得臨床關(guān)注。

綜上所述，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在hMPV快速診斷中的應(yīng)用價(jià)值較高，可獲得較為理想的靈敏度、特異度以及準(zhǔn)確度，有望成為替代傳統(tǒng)PCR的有效檢測(cè)方式，值得臨床推廣應(yīng)用。然而，該技術(shù)尚且存在一定的不足之處，有待今后的持續(xù)改進(jìn)。