基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討消癥活絡(luò)方通過ERK5通路抗大鼠肝纖維化的機(jī)制

田 樂，王穎航，潘 志

1 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春130117； 2 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 風(fēng)濕科，長(zhǎng)春130117

肝纖維化是慢性肝損傷后的一種自我修復(fù)過程，特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成和降解失衡，導(dǎo)致明顯的ECM沉積。其原因多種多樣，例如肝炎病毒感染，自身免疫性肝病以及酒精性脂肪肝或代謝相關(guān)脂肪性肝病[1-2]。肝纖維化最終可能發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌，這極大地影響了患者的生存和生活質(zhì)量[3]。在肝病誘發(fā)纖維化因子后，肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。但是，肝纖維化的分子機(jī)制尚待確定，也缺乏有效的藥物來(lái)防治肝纖維化。

消癥活絡(luò)方(XZHLF)為作者研究團(tuán)隊(duì)的臨床經(jīng)驗(yàn)方[4]，臨床效果顯著，代東雪等[5]研究表明消癥活絡(luò)方能夠明顯改善大鼠肝纖維化程度，其作用機(jī)制可能是通過降低TGFβ1的表達(dá)，從而抑制HSC的活化，降低ECM的合成。唐成芳等[4]研究表明消癥活絡(luò)方含藥血清能抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖；消癥活絡(luò)方可改善肝痹患者的臨床癥狀和相關(guān)的生化指標(biāo)。

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的飛速發(fā)展，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析成為一種揭示中草藥復(fù)雜機(jī)制的新方法。中藥在治療中具有多組分和多靶標(biāo)的特點(diǎn)。因此，新方法與中醫(yī)相結(jié)合可以促進(jìn)研究從單一藥物靶標(biāo)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟M分靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)[6]。因此，筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了XZHLF抗肝纖維化的潛在作用機(jī)制，并在前期評(píng)估XZHLF的抗肝纖維化作用的基礎(chǔ)上，使用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型通過體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.2 XZHLF“藥物-活性成分”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將XZHLF各中藥與各中藥活性成分相匹配，采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-活性成分”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 肝纖維化疾病靶點(diǎn)的獲取 通過GeneCards、OMIN數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Hepatic Fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索，得到肝纖維化疾病靶點(diǎn)，利用韋恩圖將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果取并集得到肝纖維化疾病靶點(diǎn)的全部信息。

1.4 XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)的獲取 將獲得的肝纖維化疾病靶點(diǎn)與上述獲得的活性成分靶點(diǎn)利用韋恩圖取交集，得到XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 XZHLF防治肝纖維化的“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)與XZHLF各中藥活性成分相匹配，采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析 將XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)的Gene Symbol導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析并保存結(jié)果。選取滿足P<0.001的通路，并根據(jù)富集基因數(shù)量降序排序，選取富集基因數(shù)最多的前20條，使用微生信網(wǎng)站繪制氣泡圖。

1.7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究針對(duì)前20條KEGG通路中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路進(jìn)行研究，篩選出富集在MAPK信號(hào)通路上的靶點(diǎn)、與這些靶點(diǎn)相應(yīng)的XZHLF活性成分以及與這些XZHLF活性成分相映射的其他通路，結(jié)合上述三者，利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建出“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.8 Western Blot法驗(yàn)證XZHLF對(duì)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)通路蛋白表達(dá)的影響

1.8.1 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(吉)-2018-0007；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(吉)2018-0014]。

均質(zhì)后的料液放入酶解器中，預(yù)熱至45 ℃后恒溫，用20%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0左右，再按2%～5%投料量將重組胰蛋白酶投入(添加胰蛋白酶的目的是利用胰蛋白酶將鰻魚肉蛋白水解成氨基酸，得到高含鈣的復(fù)合氨基酸混合液，再經(jīng)均質(zhì)、噴霧干燥等工藝生產(chǎn)蛋白鈣及蛋白粉產(chǎn)品，通過前期實(shí)驗(yàn)研究表明胰蛋白酶對(duì)鰻魚肉的酶解效率高)，攪拌20 min，然后加熱至60～80 ℃(10 min),使原料酶解。

1.8.2 儀器與試劑 SK-O180-E水平搖床，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器；165-8000電泳儀，170-3930轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))，美國(guó)Bio-Rad公司；全自動(dòng)低溫離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；立式鼓風(fēng)干燥箱，上海和呈儀器制造有限公司。黃芪、穿山甲、鱉甲、鉤藤、紅景天，北京同仁堂制藥集團(tuán)長(zhǎng)春分店；秋水仙堿，云南植物藥業(yè)有限公司；CCl4(分析純)，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；植物油，中糧食品營(yíng)銷有限公司；RIPA裂解液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠ERK5、p-ERK5和MEKK3多克隆抗體，美國(guó)CST公司；兔抗大鼠MEK5多克隆抗體，Abcam公司；ECL發(fā)光液，北京全式金生物技術(shù)有限公司；

1.8.3 方法 按比例稱取所需劑量的中藥飲片，按常規(guī)水煎法煎煮，最后合并濾液并濃縮(含生藥量1.96 g/ml)，4 ℃保存?zhèn)溆谩＝】礢D大鼠60只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(K組)，模型組(M組)，秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組(Y組)，XZHLF高(G組)、中(Z組)、低(D組)劑量組6組，每組10只。除K組，其余各組大鼠按體質(zhì)量背部皮下注射40%CCl4油劑3 ml/kg(首次注射5 ml/kg)[7-8]，K組給予等量體積生理鹽水，每周二、周五各1次，持續(xù)8周。造模同時(shí)給藥，G、Z、D組按照4.9 g/kg、9.8 g/kg、19.6 g/kg大鼠體質(zhì)量灌胃給藥，Y組按 0.1 mg/kg大鼠體質(zhì)量灌胃給藥，M組和K組按10 ml/kg大鼠體質(zhì)量灌胃給蒸餾水，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥8周。給藥結(jié)束后禁食12 h，取各組大鼠肝組織100 mg，放入預(yù)冷的研缽中，液氮研磨，加0.75 ml RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品至EP管中，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，混勻，95 ℃～100 ℃煮5 min。采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(40 μg)。將分離的蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1×TBST洗膜3次，每次5 min，然后將其浸入5%脫脂奶粉的TBST中常溫水平搖床搖晃封閉2 h。1×TBST洗膜3次，每次5 min，用ERK5(1∶1000)、p-ERK5(1∶1000)、MEK5(1∶1000)、MEKK3(1∶1000)和β-actin(1∶1000)一抗孵育，4℃過夜。1×TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔第二抗體(1∶1000)，常溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法獲取膠片，測(cè)定灰度值。

1.9 倫理學(xué)審查 研究方案經(jīng)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：20190035，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及靶點(diǎn) 對(duì)XZHLF各中藥進(jìn)行ADME篩選，以GI absorption=High、Drug likeness>2個(gè)yes為限定條件，篩選出110個(gè)活性成分，分別從黃芪、穿山甲、鱉甲、鉤藤、紅景天中篩選45、13、13、41、16個(gè)活性成分，其中天冬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸、纈氨酸為穿山甲與鱉甲共有活性成分，脯氨酸為鱉甲、穿山甲和黃芪共有活性成分，山奈酚為鉤藤、黃芪和紅景天共有活性成分，槲皮素為鉤藤、黃芪和紅景天共有活性成分，香豆素為黃芪和紅景天共有活性成分。在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲取923個(gè)XZHLF各中藥活性成分靶點(diǎn)。

2.2 XZHLF“藥物-活性成分”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將XZHLF各中藥、XZHLF各中藥活性成分、XZHLF各中藥活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯瑯?gòu)建“藥物-活性成分”網(wǎng)絡(luò)圖。此網(wǎng)絡(luò)共涉及115個(gè)節(jié)點(diǎn)，128條邊(圖1)。

2.3 肝纖維化疾病靶點(diǎn) 將GeneCards、OMIN數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的肝纖維化疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入到微生信網(wǎng)站，制作韋恩圖，取并集得到6823個(gè)肝纖維化疾病靶點(diǎn)(圖2)。

2.4 XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn) 將肝纖維化疾病靶點(diǎn)與XZHLF各中藥活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入到微生信網(wǎng)站，制作韋恩圖，取交集得到647個(gè)XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)(圖3)。

2.5 XZHLF防治肝纖維化的“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)與XZHLF各中藥活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。因網(wǎng)絡(luò)過于復(fù)雜，故通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯egree值≥15的潛在作用靶點(diǎn)與XZHLF各中藥活性成分構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。此網(wǎng)絡(luò)共涉及170個(gè)節(jié)點(diǎn)，1950條邊(圖4)。

2.6 XZHLF防治肝纖維化的KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析 KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析中P值代表富集程度由顏色表示，count值代表富集基因數(shù)由氣泡大小表示，橫坐標(biāo)代表基因比例，縱坐標(biāo)代表信號(hào)通路名稱。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)與MAPK信號(hào)通路關(guān)系較為密切(圖5)。GO生物過程富集分析發(fā)現(xiàn)，XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)與MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控關(guān)系較為密切(圖6)。

注：類三角形代表XZHLF各中藥，圓形代表XZHLF各中藥活性成分并用不同的顏色標(biāo)記，其中粉色代表各中藥共有的活性成分，圓形面積越大代表XZHLF各中藥活性成分連接的XZHLF各中藥活性成分靶點(diǎn)越多。

圖2 肝纖維化疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 將富集在MAPK信號(hào)通路上的靶點(diǎn)、與這些靶點(diǎn)相應(yīng)的XZHLF活性成分以及與這些XZHLF活性成分相映射的其他通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，該圖共有156個(gè)節(jié)點(diǎn)，744條邊(圖7)。

2.8 XZHLF對(duì)ERK5通路基因表達(dá)的影響 WesternBlot結(jié)果顯示，M組的大鼠肝組織內(nèi)ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白水平較K、Y、G、Z、D組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；K組的大鼠肝組織內(nèi)ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白水平較Y、G、Z、D組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖8)。

圖3 XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)韋恩圖

注：圖中粉色圓形代表XZHLF各中藥活性成分，圓形面積越大代表XZHLF各中藥活性成連接的XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)越多；藍(lán)色菱形代表XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)，菱形面積越大代表XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)連接的XZHLF各中藥活性成分越多。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 GO分類富集分析氣泡圖

注：綠色圓形代表XZHLF活性成分，藍(lán)色菱形代表富集在MAPK信號(hào)通路上的靶點(diǎn)，橙色類三角形代表信號(hào)通路。

3 討論

中醫(yī)學(xué)的“血瘀”、“癥瘕痞塊”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)纖維組織增生性疾病具有密切相關(guān)性。肝纖維化可歸屬為脅痛、黃疸、痞塊、癥瘕、積聚等范疇[9]。目前研究[10]認(rèn)為，肝纖維化是肝硬化的早期可逆階段，還未形成堅(jiān)硬不移的腫塊，為有形之癥瘕的早期，是探求有效藥物治療肝硬化道路上的一個(gè)重要突破點(diǎn)。其中醫(yī)治療方法目前可采用解毒化濕、益氣養(yǎng)陰，消癥散結(jié)、化痰通絡(luò)等方法[11]。XZHLF由黃芪、穿山甲、鱉甲、鉤藤、紅景天五味中藥組成，具有消癥散結(jié)，扶正活絡(luò)的作用。

通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)XZHLF可能通過MAPK信號(hào)通路防治肝纖維化。真核細(xì)胞內(nèi)已確定有4條MAPK信號(hào)通路, 即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2) 通路、c-Jun氨基末端激酶 (JNK) 通路、p38MAPK通路以及ERK5通路[12]。ERK5以三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)方式進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)，首先刺激因素先激活MEKK2/3，然后由激活的MEKK2/3激活MEK5，最后激活的MEK5再去激活ERK5[13-14]。MEK5是目前發(fā)現(xiàn)ERK5唯一的上游激酶。MEK5對(duì)ERK5具有高度特異性，即使過表達(dá)了也不會(huì)激活MAPK家族的其他成員[15]。研究表明，ERK5與細(xì)胞的生存、增殖和分化有著密切的聯(lián)系。ERK5通路對(duì)于心血管系統(tǒng)的胚胎發(fā)育具有重要作用[16]，在神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用[17]。有研究[18]表明ERK5信號(hào)通路在腎小球系膜細(xì)胞的病理生理過程中起重要作用，能夠誘導(dǎo)系膜細(xì)胞收縮、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚。Ramsay等[19]研究表明，ERK5介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)前列腺原位轉(zhuǎn)移癌模型有顯著的促進(jìn)形成作用。Urushihara等[20]研究表明，在慢性腎小球腎炎中，磷酸化的ERK5能夠促進(jìn)細(xì)胞活性和ECM的堆積。現(xiàn)有研究表明，MAPK家族的ERK5通路能夠通過調(diào)節(jié)ECM的表達(dá)促進(jìn)纖維化的發(fā)展，故本研究通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證XZHLF可能通過ERK5通路來(lái)防治肝纖維化。

注：與K組比較，*P<0.05;與M組比較，#P<0.05。

本研究的結(jié)果表明，與K組相比較，M組大鼠肝組織內(nèi)ERK5和p-ERK5蛋白的表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)作為ERK5級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的上游蛋白MEK5和MEKK3蛋白的表達(dá)水平也隨之明顯升高，ERK5通路被激活，蛋白表達(dá)水平明顯增加；G、Z、D組與M組相比較，ERK5通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白的表達(dá)水平均有所降低，ERK5通路受到抑制，其中G組抑制的作用最為明顯。XZHLF對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中的ERK5通路起到明顯的抑制作用，降低了ERK5在肝組織中的含量。提示XZHLF抑制肝纖維化可能是通過抑制ERK5通路的激活，減少ECM的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但其中的作用機(jī)制還不明確，需要更深一步的探索研究。

綜上，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度揭示了XZHLF防治肝纖維化可能的分子機(jī)制，并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了XZHLF可能是通過抑制ERK5通路的激活，減少ECM的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制肝纖維化的。為XZHLF的進(jìn)一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析和作用機(jī)制考察提供了參考依據(jù)，同時(shí)也使以后的相關(guān)研究更有針對(duì)性。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：田樂負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；王穎航參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；潘志負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。