肝星狀細胞在慢加急性肝衰竭小鼠模型發病進程中的作用及機制

田 臻， 王麗莎， 姚耐娟， 趙英仁， 阮驪韜

西安交通大學第一附屬醫院 a.感染科， b.超聲影像科， c.婦產科， 西安 710061

肝衰竭是病毒性、酒精性、藥物性以及缺血再灌注等多種因素引起的嚴重肝損傷。隨著人工肝、肝移植等治療手段的普及，肝衰竭患者的病死率顯著降低，但仍不低于40%[1]。在我國，繼發于慢性肝病的慢加急性肝衰竭(ACLF)約占肝衰竭患者總數的80%，肝衰竭特別是ACLF是威脅國人健康的重要疾病負擔[2]。

肝衰竭是由炎癥介導的肝細胞損傷過程，過度的炎癥反應是肝衰竭發病過程的中心環節，抑制肝臟炎癥反應能夠阻止肝衰竭的進程[3]。在肝衰竭的發病過程中，由于腸道通透性的增加，患者經常表現為內毒素血癥，即血液中內毒素(LPS)水平升高[4]。肝星狀細胞(HSC)占肝內細胞總數的5%～8%，是肝臟中肝細胞以外數量最多的細胞。研究[5-6]表明在肝癌和自身免疫性肝病的發病過程中，HSC可分泌炎癥因子促進疾病的進展。關于HSC在肝衰竭過程中的作用目前只有少數幾篇報道，HSC在肝衰竭疾病進程中的作用目前尚不完全清楚。作者的研究結果發現HSC在肝衰竭的發病過程中扮演著重要的角色：(1)在肝衰竭過程中HSC活化并分泌細胞外基質維持肝臟結構，避免肝臟塌陷從而發揮保護作用，肝衰竭過程中多種細胞因子抑制HSC活化促進肝衰竭[7]；(2)LPS通過激活NLRP3炎癥小體誘發HSC炎癥反應參與肝衰竭的發病過程[8]。然而，HSC炎癥參與肝衰竭疾病進程的具體機制目前尚不完全清楚。

研究[9]認為炎癥和氧化應激共同參與肝衰竭，肝內炎癥反應可直接誘發肝細胞損傷，損傷的肝細胞增強肝內氧化應激水平，促進肝細胞的死亡并抑制肝細胞再生，形成惡性循環。活性氧(ROS)參與多種炎癥細胞的炎癥反應過程，損傷線粒體產生ROS激活NLRP3炎癥小體，引發炎癥反應，這一機制可能也參與了肝衰竭的發病過程。最近的研究顯示，Reg3α凝集素抑制ROS進而減輕LPS+D-GalN所誘發的小鼠急性肝衰竭的過程[10]。本實驗旨在從氧化應激的角度探究HSC炎癥反應在ACLF發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性昆明種小鼠45只，6周齡，體質量(20±2) g，清潔級，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心，實驗動物生產許可證編號：SCXK(陜)2018-001，實驗動物使用許可證編號：SYXK(陜)2018-001。人血白蛋白購于瑞士杰特貝林生物制品有限公司，LPS、D-GalN及N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)購于美國Sigma公司，Annexin V-PI凋亡試劑盒購自美國BD公司，兔抗小鼠Caspase 3、Caspase 8及β-Actin單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，IL-1β及IL-6 ELISA檢測試劑盒購于美國R&D SYSTERM公司，相關生化指標檢驗試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 動物分組及模型制備 將小鼠隨機分為對照組、模型組和NAC組，每組15只。模型組和NAC組小鼠人血白蛋白致敏后，尾靜脈注射人血白蛋白15 μg/g，每周2次，共12周；之后皮下注射人血白蛋白15 μg/g，每周1次，共4周，構建小鼠慢性肝病模型；最后腹腔注射10 ng/g的LPS和800 μg/g的D-GalN誘導小鼠ACLF。NAC組小鼠ACLF造模前1周起每日按60 μg/g腹腔注射NAC，連續7 d，觀察小鼠一般狀況和病死率。小鼠死亡后立即摘除眼球取血，同時切取新鮮肝臟組織用4%中性甲醛固定，未死亡模型組和實驗組小鼠LPS+D-GalN造模后48 h時處死；對照組注射等量生理鹽水，與另兩組小鼠同一時間處死，收取小鼠血液及肝組織備用。

1.3 生化指標檢測 轉氨酶(AST、ALT)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，按說明書方法測定小鼠血清AST、ALT，肝組織MDA、SOD含量。

1.4 肝組織病理學 肝組織置于4%多聚甲醛固定液中固定12 h，經脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、常規HE染色和光學樹脂封片，顯微鏡下觀察肝組織損傷情況。肝衰竭的病理表現為大片或亞大片肝細胞壞死，間質組織塌陷，并伴有炎癥細胞浸潤。在本研究中，通過半定量病理指數評定肝臟組織病理改變：每個樣本測定10個視野，計數每個視野中病變肝細胞數所占百分比，并換算成小數。

1.5 細胞培養 人肝星狀細胞系LX2細胞和人肝細胞系HL7702細胞接種于含10%胎牛血清及抗生素的DMEM培養基中，置于37 ℃、50 ml/L CO2、95%濕度的孵育箱中傳代培養，取生長狀態良好的指數生長期細胞進行實驗，在添加(不添加)10 mmol/L NAC的情況下用1 μg/ml LPS、400 μmol/L H2O2刺激LX2細胞4 h，ELISA法檢測培養基中IL-1β及IL-6。用1 μg/ml LPS、400 μmol/L H2O2刺激LX2細胞4 h，PBS洗滌LX2細胞3次后更換培養基培養24 h，收取LX2培養基培養HL7702細胞12 h，Western Blot檢測HL7702細胞Caspase 8和Caspase 3表達，流式細胞法檢測細胞凋亡。

1.6 Western Blot檢測蛋白表達 用蛋白質抽提劑按步驟提取HL7702細胞中總蛋白，Western Blot按常規步驟進行，行SDS凝膠電泳，半干法轉膜50 min轉PVDF膜，加入兔抗小鼠Caspase 3和Caspase 8單克隆抗體4 ℃孵育過夜后應用羊抗兔IgG第二抗體孵育1.5 h，ECL發光液孵育1 min后壓X光片，顯影、壓片。

1.7 流式細胞儀檢測HL7702細胞凋亡 各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化, 制成單細胞懸液, PBS漂洗, 重懸在1×結合緩沖液中, 調細胞密度為106個/ml, 用5 μl Annexin V-FITC和1×結合緩沖液室溫孵育15 min, 然后加入400 μl 1×結合緩沖液和5 μl PI工作液, 置于冰上, 盡快對染色細胞于流式細胞儀檢測分析。

1.8 倫理學審查 本研究方案經由西安交通大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審批，批號：2018倫審科字第G-125號，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 小鼠一般狀況 對照組15只小鼠全部存活；模型組15只小鼠D-GalN+LPS造模4 h后出現活動明顯減少、豎毛、萎靡、拒食等現象，6 h后癥狀加劇并開始出現昏迷、抽搐甚至死亡，至48 h時模型組共有小鼠12只死亡，存活率達20%(3/15)；NAC組小鼠ACLF表現較模型組輕，48 h時累積生存率為53.3%(8/15)。根據各組小鼠的存活情況繪制生存曲線，采用Kaplan-Meier法分析顯示，NAC治療組小鼠48 h累積生存率明顯優于模型組(χ2=23.06，P<0.001)(圖1)。

圖1 各組小鼠的生存曲線

2.2 小鼠肝臟生化學指標檢測 與對照組及NAC組相比，模型組小鼠血清AST、ALT水平及肝組織MDA含量顯著升高，肝組織SOD水平顯著降低(P值均<0.01)(表1)。各組間血清LPS水平比較差異有統計學意義(F=42.200，P<0.01)，模型組及NAC組小鼠血清LPS水平較對照組均顯著升高(P值均<0.05)。各組間血清IL-1β水平比較差異有統計學意義(F=35.820，P<0.01)，與對照組相比，模型組小鼠血清IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，NAC組血清IL-1β水平較模型組顯著降低(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組小鼠血清LPS和IL-1β水平比較

表1 各組小鼠血清ALT、AST及肝組織MDA和SOD水平

2.3 小鼠肝組織病理改變 對照組小鼠:肝組織顏色鮮紅，質地柔軟，被膜光滑、完整，鏡下肝小葉結構清晰，肝細胞沿中央靜脈放射排列；模型組小鼠:肝臟腫脹明顯，表面可見彌漫性出血點及散在瘀斑，質地偏韌，光鏡下可見肝小葉結構破壞，肝細胞變性壞死，同時可見壞死區大量炎細胞浸潤并細胞間出血、淤血；NAC組小鼠：肝臟表面瘀斑及出血點分布較模型組輕，鏡下肝小葉破壞、肝細胞壞死及炎細胞浸潤等狀況較模型組明顯減輕(圖3)。小鼠肝臟病理評分3組間比較差異有統計學意義(F=32.250，P<0.01)，模型組小鼠肝臟病理評分明顯高于對照組和NAC組(P值均<0.05)(圖4)。

注:a,對照組；b,模型組;

圖4 各組小鼠肝臟病理評分

2.4 LPS誘導HSC炎癥反應 LPS及H2O2均可刺激LX2細胞分泌炎癥因子IL-1β和IL-6，特別發現應用抗氧化劑NAC可有效抑制LPS或H2O2介導HSC炎癥反應、減少炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌。對照組LX2細胞經PBS作用后分泌極低水平的炎癥因子IL-1β和IL-6。各組間培養基IL-1β水平比較差異有統計學意義(F=37.740，P<0.01)，IL-6水平比較差異亦有統計學意義(F=58.800，P<0.01)(圖5)。

2.5 共培養條件下HSC誘導肝細胞凋亡 經PBS作用的對照組LX2細胞與正常組相比，其誘導HL7702細胞表達凋亡相關蛋白Caspase 8、Caspase 3及細胞凋亡、壞死水平均未見明顯并異。在LX2-HL7702的共培養體系中，經LPS或H2O2刺激的LX2細胞可使HL7702細胞表達的凋亡相關蛋白Caspase 8和Caspase 3明顯增加，各組間相對表達水平比較差異均有統計學意義(F值分別為5.696、52.410、66.771，P值均<0.05)(圖6a、b)；同時通過Annexin V-PI染色用流式的方法進行了檢測，結果發現經LPS或H2O2刺激的LX2細胞可明顯促進HL7702細胞的凋亡和壞死，各組間壞死、凋亡水平比較差異均有統計學意義(F值分別為217.006、127.600，P值均<0.01)(圖6c、d)。

圖5 NAC抑制LPS誘導的LX2炎癥

3 討論

本次研究通過尾靜脈+皮下注射人血白蛋白的方法構建小鼠慢性肝病模型，并在此基礎上通過腹腔注射LPS+D-GalN構建小鼠ACLF模型。實驗結果顯示，模型組小鼠病死率達80%，肝組織HE染色可見大片肝細胞壞死，間質組織塌陷，并伴有炎癥細胞浸潤。相較于對照組，模型組小鼠血清AST和ALT明顯升高，肝組織MDA明顯升高，SOD明顯降低，表明成功建立小鼠ACLF模型。SOD是一種重要的抗氧化酶，是清除體內氧自由基的首要物質[11]，ACLF發病過程中小鼠肝臟SOD水平降低，從而導致肝臟氧化應激水平升高，參與ACLF的疾病進程。

抗氧化劑NAC有效降低模型小鼠病死率，逆轉小鼠血清、肝組織生化指標的變化。ROS激活NLRP3炎癥小體，促進炎癥因子IL-1β、IL-6釋放，炎癥因子參與多種疾病的發病過程[12]。本研究中模型組和NAC組小鼠血清LPS水平均較對照組升高，而NAC組小鼠血清IL-1β水平較模型組明顯降低。后續細胞學實驗中也發現了這一現象，即抗氧化劑NAC有效抑制LPS或H2O2誘導HSC炎癥反應，降低炎癥因子IL-1β和IL-6分泌。

注：a～b, Western Blot檢測HL7702細胞凋亡蛋白Caspase3和Caspase8的表達；c～d, Annexin V-PI染色后流式細胞術檢測HL7702細胞的凋亡和壞死。

肝臟炎癥反應與病毒性、酒精性、脂肪性和自身免疫肝病等多種慢性肝臟疾病的發病過程密切相關。炎癥參與肝硬化、肝癌和肝衰竭等肝臟疾病的不同階段。肝衰竭是炎癥介導的肝細胞損傷、死亡過程，抑制肝臟炎癥反應能夠阻止肝衰竭疾病進程[13]。HSC是肝內重要的非實質細胞，本研究和之前的研究都表明炎癥介質能夠直接激活HSC的NLRP3炎癥小體，促進HSC炎癥反應。有研究[5]表明HSC炎癥在自身免疫性肝病發病過程中發揮重要作用，HSC接收肝血竇內產生的炎癥信號，通過自身炎癥反應將其傳遞到肝實質誘導肝細胞損傷。

HSC與竇周血管內皮細胞(Sinusoidal endothelial cells, SEC)、Kupffer細胞(KC)共同構成肝血竇。生理條件下HSC的炎癥功能相對較弱，肝臟炎癥主要由KC和SEC等細胞引發[14-15]，LPS通過Toll樣受體4激活KC、SEC分泌炎癥因子，誘發肝臟炎癥反應。肝衰竭時肝臟細胞大量死亡同時HSC活化增殖，HSC占肝內固有細胞比例由正常條件下的15%上升至50%[16]，提示HSC在肝衰竭發病過程中扮演重要角色。那么HSC炎癥是否參與、如何參與肝衰竭的基本進程？針對這一問題，本研究在LX2細胞和HL7702細胞的共培養體系中探究了LPS對HSC炎癥以及HSC炎癥對肝細胞的影響，結果發現經LPS或H2O2刺激LX2細胞分泌炎癥因子促進HL7702細胞凋亡。

綜上所述，在肝衰竭的發病過程中，LPS可通過ROS促進HSC炎癥，HSC分泌相關炎癥因子進而誘導肝細胞凋亡，參與肝衰竭的疾病進程。調控炎癥或氧化應激可能成為肝衰竭新的治療靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻說明：田臻負責課題設計、擬定寫作思路；王麗莎、姚耐娟負責實驗操作、論文撰寫；田臻、王麗莎負責數據分析；田臻、趙英仁、阮驪濤負責論文審定。