環狀RNA在肝細胞癌發生發展中的作用

蔡 馨， 陳娟娟， 湯冬玲， 張平安

武漢大學人民醫院 檢驗科， 武漢 430060

肝細胞癌(HCC)是世界上常見的惡性腫瘤之一，侵襲性和轉移性較高，目前為我國第4位常見惡性腫瘤，致死率位居第2位[1]。由于HCC在早期階段缺乏有效生物標志物，患者一經確診通常為中晚期。因此，研究調控HCC的侵襲遷移機制和尋找早期HCC生物標志物，對于HCC的早期診斷、治療和預后判斷具有重要意義。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是單鏈RNA中的一個亞種，為內源性非編碼RNA，擁有共價閉合環狀結構，不具有3′端poly(A)和5′端帽子。circRNA因其環狀結構高度穩定、癌癥組織豐度高及組織相對特異等特點，參與慢性肝病惡性轉化，其表達改變有望成為HCC早期診斷與預后評估的新標志物或有效治療的新靶點。本文將綜述近幾年circRNA在HCC中的研究進展。

1 circRNA的形成及分類

circRNA于1976年在RNA病毒中首次被發現，1979年Hsu等通過電鏡在Hela細胞中發現了3′端和5′端共價相連組成的環狀分子[2]。因其特殊結構，常被當成異常的剪切副產物而被忽略。直到1993年才在人體中證實了這種結構獨特的閉合環狀非編碼RNA的存在。近年來，隨著轉錄組學基因測序技術和生物物理學技術的廣泛應用，借助高通量測序技術，circRNA的生物學功能及其在人類疾病發生發展中的作用逐漸被深入認識。

circRNA主要是通過RNA聚合酶Ⅱ處理蛋白編碼基因所形成[3]。同時circRNA生物合成是由RNA結合蛋白介導，內含子對驅動和套索驅動，因此在調節相鄰剪接位點、促進環狀生物合成方面具有重要作用。獨特的結構使其相較于線性RNA具有更高的豐度、穩定性以及保守性。

根據拼接的組成成分不同，circRNA可分為三類。(1)外顯子circRNA(exonic circRNA，E-circRNA)：是由后向剪切的外顯子組成。(2)內含子circRNA (intron circRNA，ciRNA)：僅由內含子組成。(3)外顯子-內含子circRNA(exon-intron circRNA，EIciRNA)：同時包含外顯子和內含子[4]。Jeck等[5]提出了兩種不同的外顯子環化模式，分別為lariat驅動的環化模式和內含子配對驅動的環化模式。

2 circRNA生物學功能

2.1 circRNA作為microRNA(miRNA)海綿的功能 miRNA通過直接結合mRNA調節基因表達，circRNA有多個miRNA結合位點，能發揮海綿樣吸收miRNA作用，通過miRNA反應元件競爭性與miRNA結合，在轉錄后水平減少結合mRNA的miRNA數量來調控miRNA下游靶基因表達。譬如circHIPK3可以通過結合多種miRNAs包括腫瘤抑制基因miR-124，從而對癌細胞的生長起到促進作用[6]。circ-ITCH則可以通過circ-ITCH/miR-224-5p軸來調控MafF起到抗腫瘤作用[7]。

2.2 circRNA作為轉錄翻譯的調控元件 circRNA具有調控基因表達的功能，EIciRNAs包含親代基因的內含子序列，能與轉錄機制相互影響。目前以circRNA為載體的基因表達調控機制尚未研究清楚，推測circRNA可能是通過捕捉翻譯起始位點來調節mRNA的翻譯和蛋白表達。

O’Gorman等[8]證明TFIIH特異性結合U1 snRNA，從而在早期的mRNA加工和轉錄過程中起到有效調控的作用。Li等[9]也證明了EIciEIF3J和EIciPAIP2這兩種在HEK-293中表達最豐富的EIciRNA在轉錄位點富集，因而推斷其可能促進了親代mRNA的轉錄。這些研究結果表明轉錄起始與mRNA拼接之間存在某種聯系，進而揭示了一種新型的基于circRNA協同作用的經典轉錄調控模式。

2.3 circRNA翻譯成為蛋白質與多肽的能力 大部分circRNA包含外顯子，與核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)結合后能在體內外進行翻譯。目前已有一些circRNA被證實是由IRES介導翻譯[10]，如circFBXW7、circMBl、circZNF609等。除了經典翻譯模式和上述IRES介導的翻譯模式之外，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)殘基能富集于circRNA上啟動翻譯。

3 circRNA的檢測分析

目前可以通過多種方法來分析circRNA，如circRNA的長度、序列、亞細胞定位、與各種疾病之間的關系、分子間的相互作用、生物功能等。

3.1 利用circRNA數據庫

3.1.1 circRNA信息整合數據庫 含有circBase、CIRCpedia、CircView、AtCircDB四個數據庫。主要收錄部分動植物包括人類的circRNA信息。

3.1.2 circRNA功能數據庫 circRNA除了最顯著的分子海綿功能，還有基因表達調控功能、翻譯功能等重要生物學功能。該數據庫概括了部分circRNA的生物學功能，如deepBase2.0、CircInteractome、CircNet、circRNADb、PlantcircBase、PlantCircNet、TSCD與CSCD、circlncRNAnet。以上數據庫各自針對性地收集了不同種類的circRNA功能特點以及分析結果。

3.1.3 與人類疾病相關的circRNA數據庫 該數據庫與臨床研究密切相關，在腫瘤標志物的研究或癌癥的預后判斷中都起到了重要作用，包括Circ2Traits、exoRBase、circRNA disease、CircR2Disease四個數據庫[11]。

3.2 circRNA測序技術 RNA測序技術作為基因組學的重要分析手段，已經驗證了大量circRNA。通過逆轉錄的方法對RNA進行分析，結合數字化信號測定技術，能直接了解所測circRNA的序列以及結構等信息。

3.3 circRNA基因芯片 基因芯片是集高通量與高靈敏度于一身的現存較成熟且廣泛應用的測序技術，通過將特定的有差異的探針固定于芯片上，并予以一些化學或生物標記，當待測circRNA與其結合后即可快速準確地得到其序列信息。通過基因芯片可以檢測出circPABPN1、circEPSTI1和circMTO1等circRNA。

3.4 逆轉錄PCR 該項技術可以分析機體在不同情況下體內circRNA豐度的變化，也可以進行序列分析從而得到待測circRNA連接處的序列甚至全長序列。由于circRNA類型和表達與多因素相關，如存在細胞中的不同部位，故導致逆轉錄PCR無法對circRNA進行高通量分析[12]。

4 circRNA與HCC

4.1 circRNA與HCC的發生機制 circRNA與HCC發生密切相關，通過生物信息學分析建立了circRNA-miRNA-mRNA軸上的lncRNA-mRNA共表達和ceRNA(競爭內源性RNA)網絡。circRNA發揮分子海綿作用間接調控靶基因的表達。

目前通過軟件篩選出部分共表達的circRNA、miRNA、mRNA，構建了表達網絡。主要涉及肝臟細胞的分化、周期調節、轉錄因子的負調控等功能。進一步分析表明，這些共表達的circRNA主要富集在10個通道當中，如p53信號通道以及PI3K-Akt信號通道等，且有研究[13]發現這兩個通道與HCC密切相關。

miRNA已經被證實廣泛參與肝臟腫瘤的發展過程，其調控HCC發生發展的機制涉及龐大且復雜的調控系統，其中肝癌circRNA充當miRNA的分子海綿，競爭性地結合miRNA，導致目標基因的抑制，促進肝癌細胞增殖。研究[14]表明，hsa_circ_0005986在HCC組織中明顯下調，與乙型肝炎的家族史、腫瘤直徑、血管侵犯以及巴塞羅那分期密切相關。hsa_circ_0005986通過對miR-129-5p的分子海綿作用來調節NOTCH1 mRNA的表達。hsa_circ_0005075則通過參與肝癌細胞中的細胞黏附作用[15]，以及hsa_circ_0000711被證明在HepG2和SMMC-7721中表達上調，均為通過間接調控肝癌細胞的周期來影響肝癌細胞的擴增[16]。hsa_circ_0004018在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，推測是通過分子海綿作用與miRNA結合來間接影響HCC的發展[17]。

4.2 circRNA與HCC的診斷和預后 通過GO通路分析，發現一些潛在的HCC患者特異性表達circRNA。可間接地對患者進行肝癌的篩查，有利于早期診斷。通過分析受試者工作特征曲線(ROC曲線)得到circ_104075的ROC曲線下面積(AUC)為0.973，敏感度為0.960，特異度為0.983，相比于傳統生物標志物，其對HCC診斷具有更高的敏感度和特異度[18]。hsa_circ_0128298也可能作為潛在的生物標志物，其敏感度為0.716，特異度為0.815，AUC為0.668[19]。has_circ_0016788對HCC診斷價值較高，AUC為0.851[20]。cSMARCA5與一些經典的生物標志物聯合使用可以提高HCC的診斷率，并且在肝硬化以及乙型肝炎患者中表達下調[21]。hsa_circ_0001649通過作為miR-127-5p、miR-612和miR-4688的分子海綿來激活SHPRH基因，在癌組織中表達下調并且與腫瘤分期有關，其AUC為0.63，敏感度為0.81，特異度為0.69，有望成為新的診斷標志物[22]。circADAMTS14則通過調控miR-572/RCAN1來抑制HCC的發展[23]，由于hsa_circ_0078602在癌組織中明顯下調，有望成為診斷標志物。circ FLI1E2-4作為診斷HCC的生物標志物，AUC為0.91[24]。

研究[25]發現circMTO1的表達下調與HCC患者的預后不良具有相關性，由此推測circMTO1對于HCC患者的預后具有判斷作用，而且利用探針技術確定circMTO1在細胞質中通過結合miR-9發揮作用。

表1 與HCC相關的circRNA

隨著新一代基因測序技術和生物信息學技術的發展，越來越多的circRNA在HCC中被發現。不同circRNA在HCC中的表達水平不同(表1)，提示可選擇多種circRNA共同作為HCC的潛在生物標志物，用于HCC的早期篩查和預后。

4.3 circRNA與HCC的治療 HCC患者血漿外泌體和肝組織來源circ-0051443，通過競爭結合miR-331-3p上調BAK1表達，促進癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，達到抑制癌細胞的生物學行為。同時體內研究[39]也證實circ-0051443對BAK1的調控作用，能對裸鼠HCC移植瘤生長起抑制作用。目前，已有抗癌藥物如氯化兩面針堿[40]將hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049作為靶標來治療HCC。不同的治療藥物會有不同的靶circRNA，這種靶向分子近年來已被廣泛研究，并且期待在眾多circRNA中發現HCC有效治療的分子靶目標。

4.4 circRNA與HCC干細胞 circRNA、腫瘤干細胞與癌癥緊密相關，近期發現HCC干細胞的再生與circ-MALAT1密切聯系，在RNA結合蛋白AUF1的介導下，circ-MALAT1在臨床HCC腫瘤干細胞樣本中高表達。circ-MALAT1在核糖體上阻止PAX5 mRNA翻譯，并且與核糖體以mRNA形成一個三聚體來促進腫瘤干細胞自我更新。這種阻止機制被稱為“circRNA剎車”，成為circRNA分子海綿功能外的另一種轉錄后調控機制[41]。

4.5 circRNA與免疫耐受 circMET在HCC組織中高表達，并且通過促進上皮細胞向間質細胞的轉換來促進腫瘤的發展。circMET作為miR-30-5p家族的分子海綿調節miR-30-5p/snail/DPP4軸，從而改變了腫瘤微環境，促進腫瘤免疫耐受，導致腫瘤進展[42]。

5 展望

circRNA已成為目前研究熱點，運用不同實驗技術及生物信息學分析方法發掘了circRNA的部分生物學功能以及與HCC之間的關系。通過錨定這些特定的靶circRNA，就能進一步通過其作用機理運用藥物靶向分子治療或早期診斷HCC。對于HCC的相關circRNA還有待進一步的研究探索，以期能夠在早期與傳統生物診斷指標聯合使用，對HCC進行臨床輔助篩查，從而間接提高HCC患者的生存率，做到早發現、早治療。相信隨著越來越多與HCC相關、結構多樣的circRNA被發現，對HCC復雜分子調控機制的闡明以及基于circRNA的HCC診斷與治療應用等具有廣闊的前景。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：蔡馨負責資料分析，撰寫論文；陳娟娟、湯冬玲參與文獻搜集，修改論文；張平安負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。