電刺激通過升高細胞內(nèi)游離鈣激活成纖維細胞的盆腔電刺激機制研究

吳芳芳，郁震戎，陳 慧

膠原蛋白是盆腔組織中的主要支撐結(jié)構(gòu)成分，膠原蛋白的減少和損傷等會影響盆腔組織的功能，導致盆腔組織結(jié)構(gòu)的張力降低和支撐結(jié)構(gòu)的松弛，最終導致盆腔相關(guān)疾病的發(fā)生[1-3]。成纖維細胞是最常見的結(jié)締組織細胞，會分泌包括膠原蛋白和其他大分子在內(nèi)的細胞外基質(zhì)的成分，這些成分維持軟性結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)框架[4-5]。Ca2+在電場誘導的成纖維細胞中，主要是由Ca2+穿過細胞膜中嵌入的離子通道流入細胞內(nèi)鈣存儲和細胞內(nèi)鈣存儲不參與電場誘導的Ca2+變壓門控鈣通道和拉伸激活陽離子通道被提議通過外源電場激活，并允許Ca2+從細胞外流入空間[6-8]。本研究即探究電刺激通過升高細胞內(nèi)游離鈣激活成纖維細胞的盆腔電刺激機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級Wistar大鼠（雌性，8周，100～120 g）購自南京君科生物有限公司，根據(jù)動物保護和使用委員會的標準在無病原體條件下飼養(yǎng)。所有的實驗動物程序都符合動物護理和使用委員會的審查和批準。

1.2 建立慢性盆腔炎大鼠模型和分組 選取 SPF 級8周齡的Wistar大鼠150只，體質(zhì)量100～120 g，隨機分為3組，各50只。正常對照組：正常喂養(yǎng)的大鼠。壓力性尿失禁模型的建立：在氯胺酮和賽拉嗪麻醉下，使用改良的10-Fr弗雷導管在球囊中注入3 ml生理鹽水后插入大鼠陰道，使陰道擴張4 h。電刺激組：對模型建立成功的大鼠，并在保持麻醉的同時，通過彎曲端雙極平行鉑電極（PB AD08100）隔離并懸掛靠近損傷部位的陰部神經(jīng)；電刺激（20 Hz，0.3 mA，0.1 ms脈沖）1 h。模型對照組：對模型建立成功的大鼠，不進行電刺激處理，進行正常喂養(yǎng)。

1.3 觀測指標

1.3.1 盆底兩側(cè)恥骨肌組織伊紅-蘇木素染色 將解剖得到的大鼠盆底兩側(cè)恥骨肌固定后進行脫水，濾紙吸干殘余液體，投入包埋劑中浸泡，－20 ℃恒溫環(huán)境下進行冰凍切片，后經(jīng)伊紅-蘇木素染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在光學顯微鏡下對大鼠盆底兩側(cè)恥骨肌切片進行觀察，并對每張切片進行拍照，倍數(shù)拍照盡可能容納損傷纖維肌表達。

1.3.2 利用免疫印跡法檢測各組大鼠成纖維細胞內(nèi)和細胞凋亡相關(guān)的蛋白 免疫印跡法檢測成纖維細胞內(nèi)相關(guān)凋亡因子的變化，取適量大鼠盆底兩側(cè)恥骨肌組織樣品，組織塊剪碎后加400 μl單去污劑裂解液裂進行勻漿，重復幾次使組織盡量破碎。裂解30 min后，在4 ℃下12 000 rpm離心5 min，取上清進行BCA檢測蛋白濃度；取總蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，至溴酚蘭剛跑出終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入一抗(1∶200)進行稀釋，搖床搖晃2 h；用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min，二抗孵育2 h，用0.01 M PBS洗膜3次，ECL底物發(fā)光，以目的條帶表示蛋白的相對表達量。同時根據(jù)MTT法檢測成纖維細胞活性，激光共聚顯微鏡觀察細胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。

1.3.3 血管緊張素Ⅱ和鈣-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（CaMK）Ⅱ檢測 收集各組的組織樣本，組織勻漿、提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。采用商品化的檢測試劑盒，按照說明書進行實驗，最后用酶標儀于450 nm 處檢測各孔的光密度（OD）值。在Laemmli樣品緩沖液中裂解蛋白質(zhì)，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到Immobilon-P Transfer Membrane過濾器（密理博公司，美國）上。利用標準品繪制標準曲線，計算回歸方程，由標準曲線得到待測樣本各指標的含量。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 盆底兩側(cè)恥骨肌組織伊紅-蘇木素染色 正常對照組大鼠的纖維肌組織排列緊密形狀完好，條理整齊清晰；電刺激組大鼠的纖維肌組織條理較紊亂，組織排列較緊密，形狀較完好；模型對照組的染色結(jié)果可以清楚看出纖維肌組織排列紊亂，條理雜亂無序，組織密度降低，損傷嚴重（圖1）。

圖1 盆底兩側(cè)恥骨肌組織伊紅-蘇木素染色（×600）

2.2 大鼠成纖維細胞內(nèi)和細胞凋亡相關(guān)的蛋白分析 與正常對照組比較，模型對照組Bax和cleaved-caspase-3表達量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型對照組比較，電刺激組促細胞凋亡的蛋白Bax和cleaved-caspase-3表達量下降（表1）。

表1 cleaved-caspase-3以及Bax的蛋白相對表達量（n=50）

2.3 成纖維細胞內(nèi)鈣離子的濃度與細胞增殖活性的測定 與正常對照組比較，模型對照組鈣離子濃度和成纖維活性細胞均下降；與模型對照組比較，電刺激組鈣離子濃度和成纖維細胞活性升高；在鈣離子濃度升高時成纖維細胞的活性升高（表2）。

表2 鈣離子濃度以及成纖維細胞活性測定結(jié)果（n=50）

2.4 CaMK Ⅱ檢測 模型對照組CaMK Ⅱ濃度低于正常對照組，電刺激組CaMK Ⅱ濃度低于正常對照組但高于模型對照組（P＜0.05）（表3）。

表3 CaMK Ⅱ檢測結(jié)果（n=50）

2.5 血管緊張素Ⅱ蛋白相對表達檢測 模型對照組大鼠體內(nèi)的血管緊張素Ⅱ發(fā)生了下降，電刺激組與模型對照組相比其體內(nèi)的血管緊張素Ⅱ發(fā)生了升高（表4）。

表4 血管緊張素Ⅱ蛋白相對表達檢測結(jié)果（n=50）

3 討論

電刺激可喚醒神經(jīng)傳導功能，電刺激治療能夠增強受試動物對盆腔肌肉的控制能力，該過程可能通過鈣離子通道調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型對照組鈣離子濃度下降，電刺激組鈣離子濃度高于模型對照組；與正常對照組比較，模型對照組的成纖維細胞活性下降，與模型對照組比較，電刺激組的成纖維細胞活性則升高。筆者分析認為，細胞內(nèi)鈣離子濃度可以調(diào)節(jié)許多重要的生物過程包括信號轉(zhuǎn)導、細胞骨架重組、細胞分化和增殖、細胞粘附和細胞遷移等。細胞內(nèi)Ca2+在眾多細胞的調(diào)控介導中起關(guān)鍵作用，Ca2+調(diào)節(jié)這些細胞和相關(guān)分子效應的機制被廣泛研究[9]，目前有3種已知的Ca2+途徑被認為參與細胞的調(diào)節(jié)：Ca2+可以通過激活電壓門控的Ca2+通道而在質(zhì)膜中增加；通過拉伸激活來增加Ca2+質(zhì)膜中的陽離子通道；Ca2+可通過激活內(nèi)部Ca2+存儲[10-11]。Lookin等[12]研究表明電刺激升高細胞內(nèi)鈣離子濃度，并有益于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復。李素廷等[13]研究表明成纖維細胞的調(diào)節(jié)與細胞內(nèi)鈣離子的濃度相關(guān)。廖八根等[14]研究表明血管緊張素和堿性成纖維細胞生長因子會促進成纖維細胞的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，CaMK Ⅱ濃度低于正常對照組，電刺激組CaMK Ⅱ濃度低于正常對照組但高于模型對照組。模型對照組大鼠體內(nèi)的血管緊張素Ⅱ下降，電刺激組與模型對照組相比其體內(nèi)的血管緊張素Ⅱ升高。本研究與Li等[15]研究結(jié)果一致，即血管緊張素在與受體結(jié)合后蛋白激酶C被激活，從而導致細胞膜上的鈣離子通道發(fā)生共價修飾，引起細胞膜上通道蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，導致鈣離子可以由細胞膜外進入細胞內(nèi)。鈣離子濃度的升高能夠使細胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的活性升高，腺苷酸環(huán)化酶活性的升高會導致更多物質(zhì)磷酸化的發(fā)生，導致CaMK Ⅱ的活性升高，CaMK Ⅱ是成纖維細胞增殖的重要標志物；細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高會促進p35的表達，p35的表達會抑制促細胞凋亡因子的生成，導致細胞凋亡率降低[16]。

綜上所述，細胞內(nèi)游離鈣升高可以促進成纖維細胞內(nèi)促凋亡因子的減少同時促進CaMK Ⅱ和血管緊張素Ⅱ的表達來激活成纖維細胞活性。