降解聚乙烯塑料芽孢桿菌LC-2 的分離鑒定及降解特性研究

江婷婷，丁慧平，馮麗娟，張大海，李苓，劉彥東，李先國*

(1.中國海洋大學 化學化工學院，山東 青島 266100；2.海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

1 引言

全世界每年石油基合成塑料的產量超過3 億t，廢棄塑料的環境污染問題已經引起人們的日益關注[1-2]。聚乙烯（Polyethylene,PE）塑料由于廉價、輕便、耐用的特點被廣泛用于人們的日常生活，但由于PE 是一種穩定性很好的聚合物，在環境中難以降解，容易造成“白色污染”[3]。環境中廢棄的塑料由于風化和降解作用會破碎成尺寸更小的塑料碎片，最后形成尺寸小于5 mm 的微塑料。微塑料廣泛存在于環境中[4-6]，其很有可能進入食物鏈，還可能吸附和運輸各類污染物，進而成為有毒、有害化學物質的載體，增強其在生態系統中的累積和放大作用，加劇環境和健康問題[7-11]。當前，解決塑料污染的方法主要有焚燒、填埋、微生物降解、回收利用[12]以及可降解塑料的開發等。在塑料垃圾治理方面，焚燒和填埋都會造成比較嚴重的二次污染，微生物降解則被認為是最為環保的有效途徑[13-14]，特別是在塑料垃圾集中的區域，若能找到并高效利用塑料降解菌，將是一種安全且可行的方法。目前從環境中分離得到的能夠降解PE 材料的微生物，大多數是細菌和真菌，主要包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、假單胞菌（Pseudomonasspp.）、玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous）和微桿菌（Microbacterium phyllosphaerae）等[15-20]。這些微生物大多是從土壤、垃圾填埋廠和一些生物的腸道中獲得，極少來源于海洋環境。若能從海洋環境中獲得有效降解PE 的微生物，對于豐富PE 降解微生物資源庫及促進海洋生態系統的物質和能源循環都具有積極的意義。

2 材料和方法

2.1 樣品采集

從李村河口隨機收集3 塊有嚴重分解跡象的塑料，比如有裂紋、孔洞或者有褪色等現象，放于無菌塑料袋中，低溫保存帶回實驗室。

2.2 用于細菌篩選和培養的塑料樣品的制備

市售PE 保鮮膜，將其剪成大小約3 mm×3 mm（用于降解實驗）和3 cm×3 cm（用于PE 降解菌的篩選）的塊狀。降解菌篩選和PE 降解實驗之前，樣品根據文獻[21]的方法在無水乙醇中浸泡滅菌，超凈臺中風干，室溫存放于超凈臺以備下一步使用。

2.3 培養基

培養基的配方參照文獻[17]。液體無碳培養基：0.7 g KH2PO4、0.7 g K2HPO4、0.7 g MgSO4·7H2O、1.0 g NH4NO3、0.005 g NaCl、0.002 g FeSO4·7H2O、0.002 g ZnSO4·7H2O、0.001 g MnSO4·H2O、去離子水1 000 mL，調節pH 為7.0～7.2。固體無碳培養基由液體無碳培養基添加20 g/L 的瓊脂粉制得。營養肉湯培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、去離子水1 000 mL、調節pH 為7.0～7.2。營養瓊脂培養基由營養肉湯培養基添加20 g/L 的瓊脂粉制得。以上培養基均在121℃高壓滅菌30 min。

2.4 菌株的分離篩選

將從李村河口采集的塑料樣品剪碎，裝于盛有100 mL 滅菌生理鹽水的錐形瓶中，向其中加入滅菌的玻璃微珠。使用搖床在180 r/min，35℃條件下恒溫振蕩3 h 后靜置。吸取5 mL 懸浮液加入含有100 mL液體無碳培養基的錐形瓶中，并向其中加入1 g 滅菌的PE 薄膜作為唯一碳源。為篩選合適的PE 降解菌，將錐形瓶放于搖床上，于120 r/min，35℃條件下孵育20 d。20 d 后將錐形瓶中的塑料薄膜棄去，剩余的培養液用無菌生理鹽水梯度稀釋后分別取10?4、10?5、10?6的稀釋液各0.2 mL 涂布于營養瓊脂平板上，以獲得單一菌落，用四分體劃線法將其轉接至新鮮營養的瓊脂平板上進行培養，多次轉接，直至獲得菌株的純培養物。菌株培養溫度均為35℃，共分離出52 個單一菌落。

2.5 PE 片法驗證PE 降解菌株

將所獲得的單一菌落在營養肉湯培養基中富集培養，然后6 000 r/min 離心，棄去上清液，加入生理鹽水洗滌細菌沉淀物3 次，再次離心，棄去上清液，以確保除去其中的營養物質。將獲得的細菌沉淀物重懸于生理鹽水中，吸取0.2 mL 涂布在固體無碳培養基上，在平板表面覆蓋上3 cm×3 cm 的無菌PE 薄膜，置于恒溫培養箱中，培養幾天后通過觀察PE 薄膜周邊是否有菌落形成來判斷是否是潛在的PE 降解菌。對獲得的3 株具有潛在降解PE 能力的菌株進行進一步的分子生物學鑒定。所有實驗均進行3 次平行實驗。

2.6 降解菌株的分子生物學鑒定

16SrRNA 測序在青島睿博興科生物技術有限公司進行，所得序列使用美國國家生物技術信息中心的BLAST 數 據 庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行相似性搜索，并上傳到GeneBank（gbsub@ncbi.nlm.nih.gov）獲得登錄號，從中選擇匹配度為95%以上的細菌菌株，使用MEGA7.0 軟件提供的鄰接法構建系統發育樹。

2.7 微生物接種物的制備及PE 塑料的降解實驗

2.8 分析過程

2.8.1 PE 塑料失重率的測定

為了監測降解過程中PE 塑料的重量變化，分別在實驗的第7 天、第14 天、第21 天、第28 天取樣測定PE 塑料的失重率。將培養基中的PE 塑料用孔徑為0.45 μm 的玻璃纖維濾膜過濾分離，在2%的十二烷基硫酸鈉溶液中浸泡4 h，然后用去離子水反復淋洗干凈，以除去PE 塑料表面附著的微生物膜，最后將洗凈的PE 塑料在50℃的烘箱中干燥過夜，冷卻至室溫后稱重。PE 塑料的失重率由下式計算：

2.8.2 無碳培養基中細菌濃度變化

用稀釋涂布平板法測定降解過程中培養基中游離的細菌數，分別在第7 天、第14 天、第21 天、第28 天取樣，將培養基中的液體搖勻后，吸取50 μL 培養液，用無菌生理鹽水梯度稀釋后，涂布在營養瓊脂平板上，培養24 h后，記錄菌落數，所有實驗均進行3 次平行實驗。

2.8.3 PE 塑料的SEM 分析

采用S-4800 臺式掃描電子顯微鏡（日本Hitachi）對降解前后的PE 塑料表面形貌進行表征。樣品在氬氣氣氛下濺射噴金，10 kV 真空條件下觀察并拍攝。

2.8.4 PE 塑料表面的疏水性變化

由式(3)可知，在測點半徑為10～120 mm的測試區域內，近似以r為28 mm(R為56 m·kt-1/3)為分界點，靠近爆心的區域內粒子速度峰值的冪衰減指數為1.46，遠離爆心的區域內粒子速度峰值的冪衰減指數為2.60。由表1可以看出，由r1和r2均小于30 mm區域內的實測粒子速度給出的頻率衰減因子的比例系數κ整體上明顯小于r1和r2均大于30 mm區域內的κ值。時域和頻域的分析結果都表明，在半徑r為30 mm(R為60 m·kt-1/3)附近時，球面波粒子速度峰值的衰減出現了轉折。另外，上述結果也表明：本文提出的球面波頻域分析方法給出的結果和時域的結果在物理上是相符的。

使用JC2000DM 接觸角測量儀（上海中晨數字技術設備有限公司）測定降解前后PE 薄膜表面的水接觸角（室溫下使用去離子水測定）。

2.8.5 PE 塑料的FTIR 分析

使用Nexus 670 FTIR 光譜儀（美國Nicolet）對樣品進行FTIR 表征，長度范圍為4 000～400 cm?1，分辨率為4 cm?1，掃描次數為20 次。

2.8.6 PE 塑料的分子量變化

使用烏氏黏度計（毛細管直徑為0.5 mm，上海寶山啟航儀器廠）測量降解前后PE 塑料的黏均分子量。十氫萘為溶劑，70℃恒溫水浴測量。

2.8.7 PE 塑料的熱重分析

選用TGA2 熱分析儀（梅特勒?托利多）對材料的熱穩定性進行表征，升溫速率為10℃/min，從25℃開始升溫至600℃，其流速為20 mL/min，吹掃氣為N2，保護氣（N2）流速為15 mL/min。

3 結果和討論

3.1 細菌菌株的分離與鑒定

對分離出的PE 降解菌株LC-2，選取曲霉菌（Aspergillus flavipes）作為外群，基于16S rRNA 基因序列構建系統發育分析樹。如圖1 所示，其16S rRNA 基因序列與兩株典型菌株Bacillussp.Marseille-Q1617（相似度為100%）和Bacillus aquimarisstrain PBCS1（相似度為99%）的序列以極高相似度聚在一條進化分支上，確定其為芽孢桿菌屬的一個菌株，命名為LC-2。其GeneBank 登錄號為MW199054。

3.2 PE 塑料的失重率

通過比較PE 塑料的干重損失(圖2) 來評估PE塑料的表觀降解速率。結果表明，孵育28 d 后，PE塑料的重量損失在9%左右，直觀地說明了LC-2 對PE塑料的降解。對照組在第7 天后的少量重量損失可能與PE 塑料在洗滌轉移中的損失有關。

3.3 培養基中的細菌濃度變化

從圖3 結果可以看出，在培養的前7 天，細菌濃度增長緩慢，可能是細菌對環境有一個適應過程；在第7～21 天，細菌開始大量增長，說明細菌可以利用PE 塑料作為唯一碳源來進行自身的生長繁殖；在第21～28 天，培養基中的細菌數開始下降，主要是因為培養基中的無機鹽被消耗殆盡，也有可能是細菌產生的代謝物對自身的生長繁殖起了抑制作用，或者是更多的細菌附著在了PE 塑料的表面，導致培養基中的細菌濃度降低。

3.4 PE 塑料的掃描電鏡觀察

PE 塑料表面形貌的變化是被LC-2 降解的間接證據。未接種LC-2 的PE 薄膜表面完整光滑、沒有裂痕(圖4a)；降解28 d 后的PE 塑料表面出現了明顯的孔洞（圖4b）、裂痕（圖4c）和凹坑（圖4d）。這說明LC-2 可以附著在PE 塑料表面，形成生物膜，并利用PE 塑料作為碳源，對其表面產生了破壞。

3.5 PE 塑料的表面疏水性變化

PE 材料與水的接觸角大小是其親疏水性的體現。接觸角越小，其親水性越高，越有利于微生物的定植和附著。表面親水性的增強是微生物附著在PE 塑料表面并形成生物膜的關鍵。圖5 結果表明，經過28 d 的孵育，經LC-2 降解后PE 的水接觸角為71.72°，對照組為93.54°。降解后的PE 水接觸角變小，說明其表面疏水性降低，親水性提高；也說明PE 塑料表面在LC-2 的作用下很有可能被氧化產生了親水基團。親水基團的產生有利于菌株大量附著在其表面，為菌株進一步降解PE 塑料提供了條件。

圖1 基于16S rRNA 基因序列構建的菌株LC-2 系統發育樹Fig.1 Neighbor-Joining tree of strain LC-2 constructed based on 16S rRNA gene sequence

圖2 PE 塑料的失重率曲線Fig.2 Weight loss curve of PE plastic

圖3 培養基中游離的細菌數Fig.3 The number of free state bacteria in the medium

圖4 PE 塑料的掃描電鏡照片Fig.4 Scanning electron microscopy photographs of PE plastic

圖5 PE 塑料的水接觸角圖片Fig.5 The photographs of water contact angles of PE plastic

3.6 LC-2 降解前后PE 塑料表面化學結構的變化

通常來說，羰基等基團的出現被認為是PE 氧化降解的直接證據。由降解前后PE 塑料的紅外光譜圖（圖6）可以看出，對照組可以觀察到波數在2 918 cm?1和2 851 cm?1的PE 的特征峰，分別歸屬于CH2-的不對稱和對稱伸縮振動；1 468 cm?1和725 cm?1的吸收峰則分別對應于C-H 鍵的伸縮振動和搖擺振動，與前人結果一致[22-24]。孵育28 d 后的PE 塑料，其紅外光譜在1 712 cm?1處顯示出羰基的伸縮振動峰是PE 氧化降解的標志[17]。

圖6 PE 塑料降解前后的紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of PE plastic before and after degradation

3.7 PE 塑料的分子量變化

聚合物主鏈長度的下降是其降解的一個重要指標。鏈長影響所有的降解類型，不論是物理、化學還是生物降解。鏈長越長，越難于降解。本文的結果表明，降解前PE 塑料黏均分子量的平均值是74 131±1 007，降解28 d 后的分子量平均值是60 255±775，降低了約(18.7±1.1)%。黏均分子量的降低表明LC-2 能夠利用PE 塑料，并引起鏈的斷裂，導致形成較短的片段。據報道[25-27]，細菌釋放到培養基中的胞外酶可以攻擊聚合物的主鏈，導致的聚合物分子量的降低，是聚合物鏈降解的證據。

3.8 PE 塑料的熱重分析

圖7 PE 塑料的熱重曲線Fig.7 Thermogravimetric curve of PE plastic

塑料材料的熱穩定性主要取決于聚合物鏈的類型、結構和長度。圖7 熱重曲線表明，降解后的PE薄膜熱穩定性有所提高，其失重起始溫度（435.9℃）較對照組（424.7℃）拖后，總失重率（96.42%）較對照組（98.21%）略有降低，可能與聚合物的結晶度增大有關。結晶度增大是因為PE 作為半結晶的高聚物，其晶區的結構較為規整密實，在LC-2 降解PE 的過程中，可能引起分子鏈的斷裂，破壞了纏結網絡，產生的小分子鏈段具有較強的活動性，會沿著原有的晶粒外緣發生二次結晶，使結晶度提高[28]。因此熱穩定性提高可能與較短聚合物鏈的形成有關，表明微生物可以利用PE 塑料，并形成低分子量的聚合物。

但是，顯著性檢驗（p＞0.05）結果表明，實驗組和對照組并無顯著性差異，可能是由于塑料降解的時間不長，降解程度不高（重量損失9% 左右，見3.2 節），熱穩定性變化不顯著。

4 結論

本研究從李村河口采集的塑料薄膜上分離出細菌LC-2，根據形態學特征、生理生化特征和分子生物學方法對其進行鑒定，鑒定為芽孢桿菌（Bacillus aquimaris）。LC-2 在實驗室控制條件下可以加速PE塑料的降解，并且該細菌可以在以PE 塑料為唯一碳源的液體無碳培養基中生長良好。經過LC-2 降解后的PE 塑料，其表面水接觸角變小，親水性增加；表面形貌發生了變化，產生了孔洞、裂痕和凹坑；表面被氧化產生了羰基；降解后的PE 塑料的熱重損失及黏均分子量下降。所有證據都表明了LC-2 可以降解PE 塑料。