轉錄組測序解析刺參波里氏囊腔與體腔中體腔細胞對吐臟脅迫的響應差異

史偉卜，王軼南，王浩文，任媛，王慶奎，李強*

(1.鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051；2.天津農學院 水產學院，天津 300384；3.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023)

1 引言

刺參（Apostichopus japonicus）隸屬棘皮動物門海參綱，處于從無脊椎向脊椎動物分化的獨特進化階段，也是國內外重要的海產經濟物種[1]。刺參具有獨特的水管系統，該系統是一個由體腔產生的充滿液體的復雜管道網絡，包括石管、環狀水管與輻水管等構造。石管嵌在背懸腸膜內，其末端為篩板，生在體腔內，因而水管內的液體來自于體腔液。波里氏囊作為刺參水管系統的附屬物懸掛于體腔中，具有調節水管系統內壓力的作用，通過調節水管系統內的體腔液流進或流出管足而支配其運動[2]。此外，近年來研究還發現，刺參波里氏囊可以生成體腔細胞，是刺參的“造血組織”之一[3]。

刺參的體腔細胞大量存在于體腔內，同時還隨著水管系統的延伸遍布于刺參的體壁、管足，廣泛參與著機體的營養輸送、代謝以及免疫等多種機能[2]。目前，刺參體腔細胞的相關研究多集中于體腔內游離的體腔細胞，對組織器官及水管系統內的體腔細胞了解較少。初步研究顯示[4]，刺參體腔中體腔細胞密度約為波里氏囊腔內體腔細胞密度的2 倍；波里氏囊腔內體腔細胞與體腔中體腔細胞種類相似，但亞型組成存在差異，囊腔內以帶偽足的球形細胞為主，淋巴細胞次之；體腔內則以淋巴細胞為主，帶偽足的球形細胞次之。波里氏囊腔內體腔細胞與體腔中體腔細胞組成上的差異，提示其可能具有特殊的功能[5]。

刺參具有吐臟與再生的特殊機制，當刺參遇到強烈的刺激或因水質過于混濁、溫度變化過大等不良環境時，刺參會將消化道、呼吸樹、性腺等內臟器官排出體外，當環境條件適宜時，又可再生出功能完善的內臟器官，屬于一種自我保護措施[6]。目前，有關刺參吐臟后再生的研究多集中于腸道的再生過程。已有研究表明[7?8]，刺參吐臟時，腸道與胃部、肛門以及腸系膜的連接部位分別出現斷裂，從而使得腸道從體腔中脫離下來并經由泄殖孔排出體外。這些斷裂的部位形成了新生腸道發生的原基，經過復雜的細胞增殖、轉化、去分化、組織增生等過程才逐漸形成完整的消化系統。其中，刺參腸系膜以及腸道外層存在的體腔上皮細胞被認為具有干細胞的功能作用，是消化道組織再生的重要來源，刺參吐臟時，體腔中體腔液和體腔細胞會隨內臟一起被排出。已有研究表明[9]，刺參體腔液容積在吐臟后2 h 即可恢復至吐臟前水平，體腔細胞數量在吐臟后快速增加，吐臟后6 h 時與吐臟前已無顯著差異。波里氏囊在刺參吐臟時不會和其他內臟一起排出體外，為刺參吐臟后僅存的內臟器官，我們先前研究發現，波里氏囊腔內體腔細胞數量也在刺參吐臟后6 h 快速增加（數據尚未公開），表現出積極的響應。

本文應用RNA-Seq 測序技術對刺參吐臟后6 h與吐臟前波里氏囊腔和體腔中體腔細胞進行轉錄組測序，分別比較波里氏囊腔和體腔中體腔細胞在吐臟脅迫下的基因表達變化，以期深入了解體腔細胞在刺參吐臟后所發揮的生物學作用，進一步闡明刺參波里氏囊腔和體腔中體腔細胞在功能方面的差異，并為解析刺參吐臟與再生這一特殊生存機制提供資料。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

本實驗所用刺參購于山東省青島市某水產養殖場，體重為（50.2±4.6）g，于鹽城工學院水產動物免疫與病害實驗室的塑料水槽(70 cm×50 cm×46 cm)中充氣暫養，海水溫度為17～19℃，鹽度為30，每兩天投喂和換水1 次，于18:00 進行投喂，次日早上08:00 進行換水，1 周后進行實驗。

2.2 樣品準備

將健康刺參隨機分為對照組和吐臟組，每組設置3 個平行，每個平行組放養3 頭刺參，每頭刺參注射1.2 mL 0.35 mol/L 的氯化鉀誘導吐臟，待吐臟后6 h 取樣，對照組不做處理。使用無菌手術剪沿泄殖腔一端剪開刺參腹部，將體腔中體腔液收集至一次性無菌培養皿中，另用1 mL 無菌注射器抽取波里氏囊腔內體腔液，每3 頭刺參樣品混合作為1 個平行，每組3 個平行。各組分別標記如下：波里氏囊腔內體腔細胞對照組（PC0 h）、波里氏囊腔內體腔細胞吐臟組（PC6 h）、體腔中體腔細胞對照組（CC0 h）和體腔中體腔細胞吐臟組（CC6 h）。各組取2.5 mL 體腔液樣品經4℃，3 000 r/min 離心10 min，棄上清，細胞沉淀立即置于液氮中速凍，放入-80℃冰箱保存備用。

2.3 RNA 提取及質量檢測

按照常規的Trizol 法提取上述制備的體腔細胞樣品總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質量，分析樣品RNA 完整性及是否存在DNA 污染，利用NanoDrop 微量分光光度計檢測RNA 濃度。

2.4 文庫構建及上機測序

RNA-Seq 測序文庫構建由北京諾禾致源科技股份有限公司提供技術服務，首先通過Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA 尾的mRNA，隨后將得到的mRNA 隨機打斷。以片段化的mRNA 為模版，隨機寡核苷酸為引物，合成cDNA 第一條鏈，隨后用RNaseH 降解RNA 鏈，并在DNA polymerase I 體系下，以dNTPs 為原料合成cDNA 第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA 經過末端修復、加A 尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads 篩選200 bp 左右的cDNA，進行PCR 擴增并再次使用AMPure XP beads 純化PCR 產物，最終獲得文庫。文庫構建完成后，分別使用Agilent 2100 和qRTPCR 對其進行檢測和定量，檢測合格后使用Illumina NovaSeq 6000 進行測序，并產生150 bp 配對末端讀數。

2.5 數據質控

測序獲得的原始數據中包含少量帶有測序接頭或測序質量較低的基因片段。為了保證數據分析的質量及可靠性，需要對原始數據進行過濾。從原始數據中去除帶接頭、含N（N 表示無法確定堿基信息）和低質量（Qphred≤20 的堿基數所占比例超過50%）的基因片段，從而獲得過濾后數據。同時，對過濾后數據進行Q20、Q30 和GC 含量計算。后續所有分析均是基于過濾后數據進行的高質量分析。

2.6 測序數據與參考基因組比對

刺參參考基因組和基因模型注釋文件從基因組網站下載（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/754/855/GCA_002754855.1_ASM275485v1/GCA_00275 4855.1_ASM275485v1_genomic.fna.gz）。使 用HISAT2 v2.0.5 構建參考基因組的索引，并使用HISAT2 v2.0.5將配對末端過濾后數據與參照基因組比對。

2.7 差異表達基因的篩選和富集分析

使用FPKM（expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced）法估算樣本的基因表達水平。隨后用DESeq2軟件（版本1.16.1）對兩組間的差異表達進行分析。利用Benjamini-Hochberg 方法調整所得p值（padj）以控制錯誤發現率。padj＜0.05 以及|log2（Fold change）|＞1作為顯著差異表達的閾值。通過clusterProfiler R 軟件實現差異表達基因的基因本體（Gene Ontology,GO）和KEGG 富集分析，將padj＜0.05 作為顯著性富集的閾值。

2.8 qRT-PCR 驗證

為了驗證RNA 測序結果，針對兩組樣品各選擇5 個差異基因進行qRT-PCR 驗證。其中波里氏囊腔中體腔細胞檢測金屬肽酶含血小板反應蛋白基元-9（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 9,ADAMTS9）、基質金屬蛋白酶-16（matrix metalloproteinase-16,MMP16）、維甲酸受體-β（retinoic acid receptor beta,RARB）、鈉依賴性脯氨酸轉運體（sodium-dependent proline transporter,SLC6A7）、磷酸絲氨酸轉氨酶-1（phosphoserine aminotransferase-1,PSAT1）等基因，體腔中體腔細胞檢測ADAMTS9、MMP16、RARB、SLC6A7、IgG-Fc 片段結合蛋白（IgGFc-binding protein,FCGBP）等基因。利用SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒和實時熒光定量PCR 系統進行熒光定量PCR。驗證基因的引物通過Primer Premier 5.0 設計，基因引物序列見表1。以β-actin 作為內參基因，各樣品每個基因設置3 次重復，用2?△△CT法算出每個基因的相對表達量。

3 結果與分析

3.1 測序結果概述

通過Illumina 測序平臺分別對吐臟前后共6 個波里氏囊腔內體腔細胞樣品與6 個體腔中體腔細胞樣品文庫進行測序，測序原始數據已經提交至NCBI（登錄號為SRP262929，SRP261739）。波里氏囊腔內體腔細胞樣本獲得的原始數據區間為48 395 496～58 695 018，去除低質量序列后，共獲得308 646 822 個過濾后數據；體腔中體腔細胞樣本獲得的原始數據區間為41 285 400～60 069 216，去除低質量序列后，共獲得271 994 432 個過濾后數據。兩組樣本與刺參參考基因組的比對率區間分別為66.06%～68.25%和61.10%～64.88%。堿基質量及組成分析顯示，各樣品的Q20值（%）均不小于94.87%（表2）。

3.2 差異表達分析

將過濾后數據比對到刺參的參考基因組上，PC0 h組和PC6 h 組的比較組合共獲得25 049 個差異基因，其中1 254 個基因在PC0 h 組中特異表達，1 538 個基因在PC6 h 組中特異表達，兩組共表達基因22 257個。CC0 h 組和CC6 h 組的比較組合共獲得25 682 個差異基因，其中1 433 個基因在CC0 h 組中特異表達，2 793 個基因在CC6 h 組中特異表達，兩組共表達基因21 456 個。本研究中，將|log2(Fold change)|＞1 和padj＜0.05 定義為顯著差異基因，PC6 h 組和PC0 h 組相比，共篩選出267 個顯著差異基因，其中上調基因200個，下調基因67 個。CC6 h 組和CC0 h 組相比，共篩選出922 個顯著差異基因，其中上調基因803 個，下調基因119 個（圖1）。

3.3 GO 富集分析

對PC6 h 組和PC0 h 組間的267 個顯著差異表達基因進行GO 功能富集分析，這些差異表達基因被富集到223 個GO 亞類中，包括110 個生物過程亞類，22 個細胞組分亞類，91 個分子功能亞類，其中分子功能類別中富集最為顯著。在分子功能類別中，分子功能調節、肽酶抑制活性、肽酶調節活性、酶抑制活性、酶調節活性中的差異表達基因較多。

表1 用qRT-PCR 驗證所用引物序列Table 1 The sequence of primers used for qRT-PCR validation

表2 12 個文庫的基本信息Table 2 The basic characteristic of reads in the 12 libraries

圖1 PC6 h 組與PC0 h 組（a）及CC6 h 組與CC0 h 組（b）的顯著差異基因分布火山圖Fig.1 Volcano plot significantly differential expression genes distribution between PC6 h and PC0 h (a) and between CC6 h and CC0 h (b)

對CC6 h 組和CC0 h 組間的922 個顯著差異表達基因進行GO 富集分析，這些差異表達基因被富集到385 個GO 亞類中，其中生物過程亞類202 個，細胞組分亞類27 個，分子功能亞類156 個。生物過程類別中，蛋白質水解、G 蛋白偶聯受體信號通路、單一生物轉運、神經遞質轉運、細胞黏附、生物黏附中的差異表達基因較多。細胞組分類別中，細胞外區、細胞外基質中的差異表達基因較多。分子功能類別中，分子功能調節、肽鏈內切酶活性、肽鏈內切酶抑制活性、肽鏈內切酶調節活性、肽酶調節活性、肽酶抑制活性、酶調節活性、酶抑制活性中的差異表達基因較多。圖2 列出了生物過程、細胞組分和分子功能3 個類別中差異基因顯著富集的前30 個亞類。

3.4 KEGG 富集分析

通過KEGG 富集分析結果顯示，PC6 h 組和PC0 h組間顯著差異基因共富集到15 條通路上，如甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、氨基酸生物合成、FoxO 信號通路、吞噬體等，其中顯著富集的通路是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路（圖3a）；CC6 h 組和CC0 h 組間顯著差異基因共富集到35 條通路上，其中顯著富集的通路包括細胞外基質受體互作通路、轉化生長因子-β 信號通路、FoxO 信號通路、吞噬體、AGERAGE 信號通路（圖3b）。表3 列出了顯著富集通路中的差異表達基因。

3.5 qRT-PCR 驗證

qRT-PCR 結果顯示，刺參吐臟后，波里氏囊腔中體腔細胞的ADAMTS9、MMP16、RARB、SLC6A7、PSAT1 等基因及體腔中體腔細胞的ADAMTS9、MMP16、RARB、SLC6A7、FCGBP 等基因的表達量高于對照，基因表達量的差異倍數與轉錄組測序結果大致相同。結果表明，qRT-PCR 結果和轉錄組測序結果一致，證明了RNA-Seq 結果的可靠性（圖4）。

4 討論

刺參吐臟后，體腔中體腔細胞近乎排盡，隨后迅速恢復，有研究表明[9]，體腔中體腔細胞數量在吐臟后6 h 時與吐臟前已無顯著差異。此外，我們先前研究發現，刺參波里氏囊腔內體腔細胞數量在吐臟后也快速增加，吐臟后6 h 達到峰值，之后緩慢下降（數據尚未公開）。因此，本實驗選擇吐臟后6 h 對刺參波里氏囊腔和體腔中體腔細胞進行轉錄組測序，通過與正常刺參轉錄組數據進行差異分析，分別篩選波里氏囊腔和體腔中體腔細胞在吐臟脅迫下的差異表達基因，比較波里氏囊腔和體腔中體腔細胞對吐臟脅迫的響應差異，探討體腔細胞在刺參吐臟后的生物學作用。

相對于體腔中體腔細胞在刺參吐臟前后的表達變化，波里氏囊腔中體腔細胞基因表達變化較小，共獲得267 個顯著差異基因。差異基因偏少的原因可能與刺參吐臟時波里氏囊及囊腔內體腔細胞不被排出體外，吐臟刺激對囊腔中體腔細胞的基因表達水平影響較小有關。然而，通過對差異基因的功能富集分析發現，囊腔內體腔細胞的差異基因所富集的功能和通路非常集中，差異基因大量富集至GO 功能注釋的酶催化活性亞類。差異基因通路富集分析表明，僅有1 條代謝通路（甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路）被顯著富集，其中PSAT1、甘氨酸-N-甲基轉移酶（glycine N-methyltransferase,GNMT）、肌氨酸脫氫酶（sarcosine dehydrogenase,mitochondrial,SARDH）、甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶（betaine-homocysteine Smethyltransferase,BHMT）基因均顯著上調表達。已有研究表明[10?11]，絲氨酸和甘氨酸的代謝在細胞增殖過程中起著至關重要的作用，PSAT1 被認為是連接代謝途徑（糖酵解）和氨基酸（絲氨酸）的生物合成途徑中起著重要作用的轉氨酶，PSAT1 已被證明在體外能夠促進細胞增殖。因此，刺參波里氏囊腔內體腔細胞在吐臟脅迫下，差異基因顯著富集到甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路，可能與波里氏囊腔內體腔細胞數量在吐臟后早期快速增加有關。

吐臟前后刺參體腔中體腔細胞共篩選出922 個顯著差異基因，基因表達變化非常明顯，這與刺參吐臟時幾乎排盡體腔中原有體腔細胞有關。吐臟后體腔中的體腔細胞包括由造血組織新生成的細胞以及由其他組織部位（如水管系統）遷移而來的體腔細胞，這些細胞在基因表達上可能不同于原有細胞，另一方面在吐臟脅迫下，體腔細胞亦可發生相應的表達變化。總之，吐臟后體腔中體腔細胞與正常刺參體腔中體腔細胞存在極大的表達差異。在GO 富集分析生物學過程分類中，體腔中體腔細胞差異基因在細胞黏附、生物黏附等亞類富集最顯著，在KEGG 通路中，顯著富集到細胞外基質受體互作通路、轉化生長因子-β信號通路、FoxO 等信號通路，這與波里氏囊腔內體腔細胞轉錄組所得結果存在很大差異。

細胞外基質是存在于所有組織和器官中的非細胞成分，它不僅為細胞成分提供了必要的物理支持，而且還與組織的形態發生、分化和內穩態有關，在創面愈合和組織重建等方面發揮著重要作用[12?13]。有研究表明[14?15]，細胞外基質重建與海參吐臟后腸道再生過程中的傷口愈合和組織恢復有關，海參腸系膜的愈合和局部生長大部分是因為腸系膜邊緣的組織重組，而不是來自于有絲分裂。此外，García-Arrarás 等[15]通過光鏡和免疫組化研究顯示，海參腸道再生過程中，腸系膜結締組織與新生消化道的結締組織相連處出現了正在遷移的變形細胞、血細胞、淋巴細胞和桑椹胚細胞。孫麗娜[16]研究發現，刺參新生腸壁的內部結締組織大約有4 種類型細胞：未分化細胞、變形細胞、桑椹胚細胞、淋巴細胞，4 種細胞的數目在再生過程中都表現出先增高后降低的趨勢，最終恢復到正常水平。本研究中，體腔中體腔細胞差異表達基因被顯著富集到細胞外基質受體互作通路，其中軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）、膠原蛋白Ⅳ型α5 鏈（collagen alpha-5(IV) chain,COL4A5）、膠原蛋白Ⅸ型α2 鏈（collagen alpha-2(IX) chain,COL9A2）、血小板反應蛋白（thrombospondin-1,THBS-1）和基底膜特異性硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白（basement membrane-specific heparan sulfate,HSPG2）等基因均顯著上調。因此，我們推測刺參吐臟后再生早期，體腔中體腔細胞可能通過自身的遷移黏附和大量分泌細胞外基質，參與刺參內臟器官的再生過程。

圖2 GO 富集分析中顯著差異基因的功能分類Fig.2 Functional categorization of significantly differential expression genes in Gene Ontology

圖3 顯著差異基因的KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment of significantly differential expression genes

表3 顯著富集通路中的差異表達基因Table 3 The differential expression genes in significant enrichment pathways

續表3

圖4 qRT-PCR 驗 證RNA-Seq 結果Fig.4 Verification of the RNA-Seq results using the qRT-PCR method

關于海參體腔細胞的來源，目前研究還沒有確切結論，不過普遍認為是由“造血組織”產生一種類似于造血干細胞的祖原細胞，在體腔中再分化形成其他類型的體腔細胞[3,17?18]。本研究中，刺參吐臟后體腔中體腔細胞差異基因顯著富集到FoxO 信號通路，細胞周期蛋白B（Cyclin B）和POLO 樣蛋白激酶（polo-like kinase,Plk）基因顯著下調。Cyclin B 是細胞周期前期/中期轉變的重要調控因子，它通過激活cdc28 蛋白激酶和相應底物的磷酸化來促進多種生物進入有絲分裂[19?20]。Plk 是細胞分裂的重要正向調節因子，在有絲分裂、雙極紡錘體形成、染色體分離和胞質分裂等過程中起關鍵作用[21?22]。因此，本實驗中Cyclin B 和Plk基因的下調表達，提示刺參吐臟后再生早期，體腔中體腔細胞的有絲分裂活動減弱。我們先前研究發現，刺參吐臟后體腔中體腔細胞近乎排盡，而在吐臟后6 h細胞數量快速增加，與吐臟前已無顯著差異。綜合轉錄組結果分析認為，刺參吐臟后再生早期體腔中體腔細胞數量快速增加的原因，并不是由造血組織快速增殖產生，而主要是由其他組織部位（如水管系統）遷移而來。

TGF-β 信號通路可通過調節細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程，在組織與器官的發生和形成、機體的免疫反應等生物過程發揮重要的功能[23]。本研究中，體腔中體腔細胞差異表達基因被顯著富集到TGF-β 信號通路，其中骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、THBS-1 等基因顯著上調。已有研究證實，作為TGF-β 超家族成員，BMP 的功能不僅在骨骼，而且在胚胎早期形成以及許多器官和組織的發育和分化過程中都發揮重要作用[24]。近年來，越來越多的學者關注該基因家族與再生的關系，發現它們參與誘導動物再生，如蠑螈晶狀體再生[25]、海參消化道再生[26]、大鼠的指尖再生[27]、非洲爪蟾幼體的尾部和肢體再生[28]等。本研究中，刺參吐臟后體腔中體腔細胞BMP 和THBS-1 基因上調表達，提示刺參吐臟后體腔中體腔細胞可能通過分泌釋放生長因子，進而參與內臟器官的再生過程。

綜上，本文分別對刺參吐臟后6 h 與吐臟前波里氏囊腔和體腔中體腔細胞進行轉錄組測序，比較了波里氏囊腔與體腔中體腔細胞在吐臟脅迫下的基因表達變化。研究結果表明，刺參波里氏囊腔與體腔中體腔細胞對吐臟脅迫的響應存在明顯差異，這對進一步研究刺參體腔細胞的功能及揭示刺參吐臟后的再生機制提供了重要基礎。