瑤族復方山茶油對變應性接觸性皮炎小鼠的作用及機制研究

馮秋瑜，黎敏航，胡宇婷，黃慧學，3，梁秋云

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200；2.桂林醫學院，廣西 桂林 541199；3.廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西 南寧 530200）

新生兒尿布疹，是由于被大小便浸污的尿布未及時更換或細菌感染等造成新生兒的尿布包裹區域出現紅腫、水皰、膿皰，甚至出現潰爛等皮膚炎癥反應，屬于變應性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）的范疇［1-2］。病灶部位的皮膚再次或反復接觸過敏原，特異性T細胞大量聚集于接觸部位，分泌過量的細胞因子，引發炎癥反應［3］。目前，尿布疹發生率高達43.8%，由于過敏原排查難度大，臨床用藥存在很大的隨意性和盲目性［4］。本課題組在前期調研中發現，瑤族民間常用山茶油混合扛板歸、火炭藤、黃連、黃柏等藥材涂抹于尿布疹部位，效果顯著。本研究通過2，4-二硝基氯苯（DNCB）誘導的小鼠ACD模型，探討瑤族復方山茶油的作用及機制。

1 實驗材料

1.1 動物 BALB/c小鼠，雄性，3周齡，體質量14～16 g，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK桂2014-0002；動物使用許可證號：SYXK桂2014-0003。小鼠在實驗前適應性飼養3 d。

1.2 試藥 ①瑤族復方山茶油（SCY）：將蛇不過、火炭藤、黃連、黃柏、石韋等藥材搗爛，加山茶油適量，浸泡48 h，用80目篩濾過除去藥渣，得到高劑量瑤族復方山茶油（SCY-H，0.50 g生藥/ml），取SCY-H適量，用山茶油稀釋得中劑量瑤族復方山茶油（SCY-M，0.25 g生藥/ml）、低劑量瑤族復方山茶油（SCY-L，0.125 g生藥/ml），備用。上述藥材由廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定：山茶油為山茶科植物油茶（Camellia oleiferaAbel）的種子經壓榨而得的植物油；扛板歸為蓼科植物扛板歸Polygonum perfoliatumL.的莖葉；火炭藤為蓼科植物火炭母Polygonum chinenseL.的全草；黃連為毛茛科植物短萼黃連Coptis chinensisFranch.var.brevisepalaW.T.Wang et Hsiao的根莖；黃柏為蕓香科植物禿葉黃皮樹Phellodendron chinense var.glabriuscu?lumSchneid.的樹皮；石韋為水龍骨科植物廬山石韋Pyrrosia sheareri（Bak.）Ching的全草。②尤卓爾丁酸氫化可的松乳膏：每1 g含丁酸氫化可的松1.0 mg，天津金耀藥業有限公司產品，批號：17100301。用時稀釋至1 mg/ml的濃度。③2，4-二硝基氯苯（DNCB）：美國Sigma-Aldrich產品。

1.3 試劑 IgE、INF-γ、IL-4等ELISA試劑盒：美國BD Biosciences產品。

2 方 法

2.1 造模及藥物干預 取BALB/c小鼠60只，按隨機數字表法分為6組：正常對照組、模型組、SCY-H組、SCY-M組、SCY-L組和氫化可的松組，每組10只。除正常對照組外，其余小鼠于實驗前1 d腹部刮毛，面積約3 cm×3 cm，以5% DNCB丙酮-橄欖油（4∶1）溶液致敏，每只涂予25μl。致敏后5 d，于小鼠右耳以0.25%DNCB丙酮-橄欖油（4∶1）溶液20μl激發，左耳涂等量丙酮-橄欖油（4∶1）作對照［5］。各實驗組于DNCB激發后1 h開始給藥，每隔1 h給藥1次，連續給藥7次。氫化可的松組和SCY各劑量組涂以相應藥物，每次25μl，正常對照組和模型組以蒸餾水替代。

2.2 觀察指標與方法

2.2.1 耳腫脹度及耳腫脹抑制率的測定 DNCB激發后24 h，脫頸處死小鼠，剪下雙耳，用6 mm打孔器取雙耳片，稱重，計算耳腫脹度和耳腫脹度抑制率。公式如下：耳腫脹度（mg）=右耳質量-左耳質量；耳腫脹抑制率（%）=（模型組右耳質量平均值-實驗組右耳質量）/模型組右耳質量平均值×100%。

2.2.2 血清中IgE含量的測定 小鼠處死前5 min行眼球采血，4℃、3 500 r/min離心15 min，分離血清，按試劑盒說明書測定血清中IgE的含量。

2.2.3 耳勻漿中INF-γ和IL-4含量的測定 取稱重后的右耳，用預冷的PBS研磨制成2.0%的勻漿，4℃、3 500 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書測定勻漿液中INF-γ和IL-4的含量，計算INF-γ/IL-4比值。

2.3 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，各組數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較選用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗。

3 結 果

3.1 SCY對ACD小鼠耳腫脹的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠耳腫脹明顯（P＜0.01）；與模型組比較，氫化可的松組和SCY各劑量組對小鼠耳腫脹均有明顯抑制作用（P＜0.01），且SCY對小鼠耳腫脹抑制率與劑量呈正相關性（P＜0.05）。結果見表1。

表1 SCY對ACD小鼠耳腫脹的影響（n=10，x±s）

3.2 SCY對ACD小鼠血清中IgE和耳勻漿中INF-γ、IL-4含量的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清中IgE和耳勻漿中INF-γ、INF-γ/IL-4比值明顯升高（P＜0.01），而耳勻漿中IL-4水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，SCY高劑量組能降低血清中IgE水平（P＜0.01）；SCY各劑量組還能抑制耳勻漿中的INF-γ上升，恢復INF-γ/IL-4比值的平衡（P＜0.05或P＜0.01），但對IL-4水平未見明顯影響（P＞0.05）。結果見表2。

表2 SCY對ACD小鼠血清中IgE和耳勻漿中INF-γ、IL-4含量的影響 （n=10，x±s）

4 討 論

目前，隨著嬰幼兒護理技術和方法的不斷提高，以大面積糜爛、潰瘍的Ⅲ度尿布疹已少見，多為肛周與臀部皮膚紅腫，或有少量潰爛、滲出的Ⅰ、Ⅱ度尿布疹［6］。本實驗采用小鼠右耳接受抗原DNCB刺激后，再次接觸DNCB而表現出的紅斑、水腫及易有滲出液的ACD特征，與臨床Ⅰ、Ⅱ度尿布疹病理學特征相似。依據首都醫科大學附屬醫院皮膚科推薦的尿布疹療效診斷標準，用藥24～48 h后臀部紅斑、丘疹等消退為顯效；用藥72 h后潰瘍消失，局部丘疹、水腫基本消退為有效［7］。因此，本實驗采用1 d內多次給藥、觀察瑤族復方山茶油給藥后24 h的療效。在本實驗中，模型組小鼠耳腫脹明顯，血清中IgE水平顯著上升，符合ACD病理過程。SCY在24 h內能明顯抑制小鼠耳腫脹，且存在劑量依賴性；SCY高劑量組還能顯著降低血清中IgE水平，提示SCY對ACD的改善作用與其降低機體的過敏反應有關。

瑤藥的組方配伍主要為主藥、配藥和引路藥?，庒t認為［8］，尿布疹發病原因主要是由于新生兒胎中蘊毒未清，或因其后天喂養不當，飲食失調，脾胃受損，濕熱之邪浸淫血脈，郁于肌腠?；純函彾荆ㄌザ荆┗驖駸嶂斑^盛為盈，機體脾胃受損為虧，盈虧失衡，發為本病。治則為風虧打盈，打其毒邪之盈，健其脾胃；治法為清熱燥濕、散瘀消腫、祛風止癢、健胃利水。瑤族復方山茶油中的山茶油，味苦，性平，具有行氣除滯、消腫止痛、清熱解毒、殺蟲止癢之功效，屬于打藥；扛板歸與火炭母能清熱解毒、收斂止癢、利水消腫，皆為打藥，能助山茶油清熱止癢、消腫止痛；黃連與黃柏能清熱燥濕、解毒療瘡，為風打相兼藥，助主藥加強涼血解毒、療瘡止癢之功；石韋清熱解毒、利水通淋，為風藥，用之作引路藥，引瘡毒和濕邪下行；以上風虧打盈配伍，能起到清熱燥濕、散瘀消腫、祛風止癢的功效。因本復方為外用藥，故在治標之際，仍需在患兒日常喂養時注意調養其脾胃，最終達到標本兼治的目的。

研究表明，ACD主要是由Th1細胞介導、Th2細胞和多種細胞因子參與的Ⅳ型超敏反應，其中Th1/Th2比值的失調是重要環節［9］。Th1細胞能活化巨噬細胞，介導細胞免疫應答；Th2則輔助B細胞活化，發揮體液免疫的功能。INF-γ和IL-4分別是Th1和Th2細胞分泌的代表性細胞因子，二者之間存在交互調節、相互拮抗的作用，維持著免疫平衡的作用［10］。當INF-γ和/或IL-4水平異?？梢lTh1/Th2比值改變，導致ACD的發生［11］。在本實驗中，模型組小鼠耳勻漿中INF-γ水平明顯升高，而IL-4則顯著降低，導致INFγ/IL-4比值增大；通過SCY的治療，雖然IL-4水平上升水平不顯著（P＞0.05），但能下調INF-γ水平，恢復INF-γ/IL-4比值的平衡，提示SCY對ACD的作用機制與下調炎癥部位INF-γ水平及調節Th1/Th2平衡有關。