太湖花鱉雌雄群體形態(tài)及遺傳差異分析

王苗苗　梅肖樂　馮子偃　徐建榮　韓曉磊

摘要：通過多元統(tǒng)計分析和線粒體DNA測序技術(shù)，對中華鱉地方特色品種——太湖花鱉雌雄群體的形態(tài)和遺傳差異進(jìn)行了分析研究。結(jié)果顯示，在形態(tài)上，對太湖花鱉雌雄群體各項形態(tài)參數(shù)進(jìn)行t檢驗差異分析，發(fā)現(xiàn)雄性尾部的生長與其體質(zhì)量的增加相關(guān)顯著，呈線性關(guān)系;對太湖花鱉雌雄群體形態(tài)參數(shù)進(jìn)行主成分分析，并作出主成分1和主成分2的散點圖，得出雌雄群體形態(tài)差異不明顯。對太湖花鱉雌雄群體線粒體D-loop控制區(qū)序列進(jìn)行差異分析，雌雄群體間遺傳差異為0.0114;構(gòu)建N-J聚類系統(tǒng)樹，雌雄群體無單獨聚類，群體遺傳差異不明顯。結(jié)果表明，太湖花鱉個體形態(tài)差異與其性別存在一定程度的相關(guān)性，特別是尾部特征，可用于雌雄性別的初步判斷，但雌雄群體在外觀形態(tài)和線粒體DNA上均沒有明顯差異。

關(guān)鍵詞：太湖花鱉;多元統(tǒng)計分析;D-loop控制區(qū);形態(tài)差異;遺傳差異

中圖分類號：S966.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0142-04

作者簡介：王苗苗（1987—），女，江蘇南京人，碩士，水產(chǎn)工程師，主要從事水生生物學(xué)研究和水產(chǎn)技術(shù)推廣工作。E-mail：miaomiaotgz@163.com。

通信作者：韓曉磊，碩士，高級實驗師，從事淡水水生生物學(xué)研究。E-mail：84125241@qq.com。

多元統(tǒng)計分析可根據(jù)形態(tài)特征的多個參數(shù)，對多個互相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)和對象進(jìn)行統(tǒng)計分析以揭示其規(guī)律，符合農(nóng)業(yè)科學(xué)的研究特征[1]。目前，多元統(tǒng)計分析已在水生動物的物種種質(zhì)評定、種群遺傳變異、性別差異分析等領(lǐng)域開展了大量的研究，然而對龜鱉類物種的研究還鮮有報道[2-6]。線粒體DNA作為細(xì)胞中遺傳信息的重要載體，具有長度短、含量高、進(jìn)化速度快和母性遺傳等特點，特別是D-loop控制區(qū)，因其不編碼蛋白，承受選擇壓力較小，是線粒體DNA中進(jìn)化最快的部分，已成為水生動物種類鑒定、遺傳多樣性、遺傳變異、系統(tǒng)進(jìn)化、性別差異等方面的研究熱點[7-13]。

太湖花鱉屬于中華鱉（Trionyxsinensis）的地方特色品種，主要分布于長江中下游，太湖流域居多，與普通中華鱉體色差異較大，特別是在自然狀態(tài)下體色油綠，背部有對稱小圓黑斑，腹部有明顯塊狀灰黑花斑，由此得名;并因其較高的營養(yǎng)價值和良好的口感風(fēng)味受到人們青睞，江南地區(qū)多有養(yǎng)殖，市場前景廣為看好。太湖花鱉雌雄體在形態(tài)規(guī)格及生長特性上存在一定差異，本研究通過多元統(tǒng)計分析和線粒體D-loop控制區(qū)分析，于表型和基因型多方面對太湖花鱉雌雄特征予以揭示，以期為太湖花鱉雌雄鑒別，以及種質(zhì)鑒定、資源保護(hù)和利用提供一定的理論支持。

1材料與方法

1.1材料來源

太湖花鱉樣品是在2017—2018年取自太湖常州武進(jìn)段的野生群體，共計取樣30只，其中，雌雄各半，試驗于2019年在長江特色水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心完成。太湖花鱉活體用于形態(tài)參數(shù)統(tǒng)計分析，之后取樣品腿部肌肉組織于-70℃冰箱中保存，以備提取DNA使用。

[FK（W11][TPWMM11.tif;S+3mm][FK）]

1.2形態(tài)參數(shù)測量

游標(biāo)卡尺測量每尾太湖花鱉的體高、頭長和頭寬等16項形態(tài)指標(biāo)（精度為0.1mm），電子天平測量每尾太湖花鱉的體質(zhì)量（精度為0.1g），具體測量方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)（GB2104—2007）[14]，具體指標(biāo)見表1、表2。鑒于活體太湖花鱉不便于測量，故可將其放入密閉容器，進(jìn)行乙醚吸入式麻醉后方可精確測量。

1.3D-loop控制區(qū)的PCR擴(kuò)增及測序

參照韓曉磊等的研究方法[15]提取太湖花鱉樣品基因組DNA并檢測其完整性，測定其濃度后于-20℃保存?zhèn)溆谩ＬM2對擴(kuò)增D-loop控制區(qū)的引物序列分別為：T1（5′-3′）：[JP9]ATCTTACCCCTACTACACACAT;T2（5′-3′）：[JP9]AGACTGGTGATGGAGTATC;T3（5′-3′）：[JP9]GCCACAATACTTGTTTATCT;T4（5′-3′）：[JP9]AATATCCATCTTGGCGTCTTCA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參見陸文浩等的方法[16]具體操作，并測得太湖花鱉樣品線粒體DNA序列。

1.3數(shù)據(jù)處理

1.3.1形態(tài)參數(shù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，本研究多元分析方法包括t-檢驗和主成分分析，它們是針對多個研究對象同時進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的運(yùn)算方法。通過將背甲長作為基數(shù)，以取得2個形態(tài)參數(shù)比值，從而消除鱉體規(guī)格大小對多元分析中參數(shù)值的影響。

1.3.2D-loop控制區(qū)序列分析

所獲得太湖花鱉D-loop控制區(qū)序列經(jīng)過校對處理后，采用軟件ClustalX2.1和MEGA5.1進(jìn)行序列比對和分析，通過Kimura雙參數(shù)模型統(tǒng)計雌雄群體群間遺傳差異，運(yùn)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，以bootstrap進(jìn)行檢驗，重復(fù)1000次。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)差異分析

由表1可知，太湖花鱉雄鱉體質(zhì)量與尾長關(guān)系的r=0.662（r>r0.01），尾部生長與體質(zhì)量增加相關(guān)性顯著，其一元線性回歸方程為：Y體質(zhì)量=44.473X尾長+115.837，回歸顯著性檢驗F=10.143，F(xiàn)>F0.01;太湖花鱉雌鱉體質(zhì)量與尾長關(guān)系的r=0.445（r

2.2主成分分析

由表2可知，太湖花鱉雌雄群體方差貢獻(xiàn)率較高的4個主成分貢獻(xiàn)率分別為43.163%、14.427%、8.812%和8.600%，其累積貢獻(xiàn)率為75.003%，包含了群體總變異的大部分，可見以上4個相互獨立的主成分可代表太湖花鱉雌雄群體間的形態(tài)差異。在主成分1中，變量X2、X3、X4、X6、X7、X8、X9、X12和X13影響最大;在主成分2中，變量X10、X11和X14影響最大;在主成分3和主成分4中，變量X2影響最大。背甲周長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬和尾長是主成分1變異貢獻(xiàn)的主要形態(tài)指標(biāo)，可見太湖花鱉鱉體長度、寬度和尾長是引起其雌雄群體形態(tài)差異的主要指標(biāo)。

由圖2可知，太湖花鱉雌雄群體主成分1和主成分2為相對值，雌雄群體之間存在部分重疊，主成分1和主成分2不能準(zhǔn)確將雌雄群體進(jìn)行區(qū)分，故太湖花鱉雌雄群體總體形態(tài)差別較小，形態(tài)差異統(tǒng)計分析較難將其準(zhǔn)確鑒別。

2.3D-loop控制區(qū)序列分析

2.3.1太湖花鱉線粒體D-loop控制區(qū)序列比較

測序所得序列與GenBank中序列號為AY687385.1的中華鱉線粒體DNA序列進(jìn)行Blast同源性比對，證實所測序列位于第15321位到15835位之間，大小為515bp，堿基組成分別為G、C、T和A的堿基平均含量分別為10.0%、30.0%、32.9%和27.1%，其中T+A含量（60.0%）高于G+C含量（40.0%），是線粒體DNA典型的反G偏倚特征。太湖花鱉雌雄群體的群內(nèi)遺傳相似度為99.23%。

2.3.2太湖花鱉分類地位鑒定

根據(jù)D-loop控制區(qū)序列差異，用MGEA5.1分析2個群體的遺傳距離，由圖3可知，發(fā)現(xiàn)雌雄群體間遺傳差異為0.0114。構(gòu)建聚類系統(tǒng)發(fā)生樹，太湖花鱉雌雄群體混為一體，群內(nèi)個體無單獨聚類。

3討論

t檢驗是用于小樣本（樣本容量小于30）的2個平均值差異程度的檢驗方法，它是用T分布理論來推斷差異發(fā)生的概率，從而判定2個平均數(shù)的差異是否顯著[17-18]。本研究中，太湖花鱉雄性尾巴的生長與其體質(zhì)量的增加顯著相關(guān)，可用于太湖花鱉雌雄性別的鑒別;主成分分析中尾長也是引起形態(tài)差異的主成分變量之一，且需與其他形態(tài)變量共同作用進(jìn)行差異分析。珠水對中華鱉性別鑒別方法進(jìn)行了研究，指出雄性中華鱉較之雌性尾巴較長，大多能自然伸出裙邊外，故尾部特征可以作為雌雄判別的重要依據(jù)[19]，此結(jié)論與本研究結(jié)果基本一致。然而，在太湖花鱉雌雄群體30個樣本的散點圖分析結(jié)果中，太湖花鱉雌雄群體并沒有明顯區(qū)分。以上推斷表明，太湖花鱉個體形態(tài)差異與其性別存在一定程度的相關(guān)性，特別是尾部特征，可用于雌雄性別的初步判斷，但其群體的形態(tài)差異并不明顯，還需更多的參數(shù)乃至更深入的分析研究予以揭示。

本研究通過線粒體D-loop控制區(qū)序列比對差異分析，發(fā)現(xiàn)太湖花鱉雌雄群體群間遺傳差異僅為0.0114，可以認(rèn)為2個群體間不存在有效遺傳差異。太湖花鱉雌雄群體聚類系統(tǒng)發(fā)生樹中2個群體的群內(nèi)個體未按照性別差異單獨聚類，同樣揭示雌雄群體群間遺傳差異并不明顯。

綜上所述，太湖花鱉雌雄群體在外觀形態(tài)上可通過尾巴長短進(jìn)行簡單區(qū)分，但進(jìn)行準(zhǔn)確的分辨還相對較難，線粒體DNA差異同樣不明顯。由此推斷，太湖花鱉雌雄群體差異在外觀形態(tài)只有微小的體現(xiàn)，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，雄鱉生長速度快于雌鱉，成熟的雄性個體比雌性大且一般為雌性的3倍左右[17]，揭示太湖花鱉雌雄差異可能主要體現(xiàn)在生長速度上，故體質(zhì)量的變化可作為研究方向。

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