長(zhǎng)江口中華絨螯蟹雌蟹洄游期的腸道菌群多樣性

徐靜靜　馮廣朋　陳建華　孫雪娜　黃曉榮

摘要：采集長(zhǎng)江口生殖洄游期中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）雌蟹樣品，利用16SV4區(qū)高通量測(cè)序技術(shù)研究其抱卵前后腸道菌群的多樣性特征，探討腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及與其食性特征的相關(guān)性。結(jié)果表明，雌蟹抱卵前和抱卵后的腸道樣品中共檢測(cè)出313個(gè)和376個(gè)OUT，特有OUT分別為112個(gè)和175個(gè)，占比分別為35.78%和46.54%。就門水平而言，柔膜菌門（Tenericutes）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）是其腸道的主要菌群;雌蟹抱卵前和抱卵后的腸道菌群具有顯著性差異，變形菌門和厚壁菌門的豐度抱卵后小于抱卵前，而柔膜菌門豐度抱卵后大于抱卵前。就屬水平而言，Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma是其腸道的主要菌群屬，抱卵前占比分別為26.54%和25.81%;抱卵后占比分別為30.29%和29.05%，2個(gè)屬的豐度在抱卵前后無(wú)顯著差異。與抱卵前相比較而言，抱卵后雌蟹腸道菌群Chao指數(shù)和ACE指數(shù)升高，豐度增加，而辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)保持穩(wěn)定，抱卵前后雌蟹腸道菌群的多樣性無(wú)顯著性變化。本研究揭示由于長(zhǎng)江口中華絨螯蟹雌蟹的攝食習(xí)性和餌料組成在抱卵前后產(chǎn)生了變化，會(huì)對(duì)其腸道微生物多樣性產(chǎn)生一定的影響。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）;高通量測(cè)序;腸道菌群;多樣性

中圖分類號(hào)：S932.5+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）01-0146-06

作者簡(jiǎn)介：徐靜靜（1992—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事水生動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail：65807898@163.com。

通信作者：馮廣朋，博士，研究員，主要從事漁業(yè)資源增殖養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：fgp7711@163.com。

中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）俗稱河蟹，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江、黃河、甌江等流域[1]，屬于洄游性甲殼類動(dòng)物，受精卵在河口淺海處孵化成幼體后，溯河洄游至長(zhǎng)江中部的淡水湖泊中進(jìn)行生長(zhǎng)肥育，當(dāng)親蟹性腺發(fā)育成熟后，重新生殖洄游至長(zhǎng)江口咸淡水處進(jìn)行交配產(chǎn)卵，產(chǎn)卵場(chǎng)主要位于長(zhǎng)江口崇明東灘及九段沙下游水域（121°58′～122°12′E、31°05′～31°22′N）[2]。胃含物形態(tài)學(xué)食性鑒定分析表明，洄游期的中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后餌料來(lái)源多樣，包括水生植物、藻類、甲殼類、多毛類、魚類、軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、卵、顆粒碎屑等，屬雜食性水生動(dòng)物[3]。同哺乳動(dòng)物一樣，水生動(dòng)物腸道中亦擁有豐富多樣的微生物。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的適應(yīng)和自然選擇，腸道菌群和宿主最終可形成相互依賴的共生體系。一方面，腸道菌群依靠宿主養(yǎng)分賴以生存，另一方面，腸道菌群在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的消化酶、維生素等產(chǎn)物可促進(jìn)宿主機(jī)體的消化與營(yíng)養(yǎng)吸收[4]。如朱曉燕等研究發(fā)現(xiàn)，魚類腸道中嗜水氣單胞菌分泌的胞外酶可促進(jìn)淀粉和蛋白質(zhì)的消化[5]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，飼料中益生菌的添加可改善腸道菌群組成，抑制腸道內(nèi)有害菌群的繁殖，提高宿主的消化機(jī)能，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[6-8]。

16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)能夠深入分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，具有速度快、準(zhǔn)確率高、靈敏性強(qiáng)等特點(diǎn)，被越來(lái)越多的學(xué)者應(yīng)用于腸道菌群多樣性的研究[9-11]。目前，關(guān)于魚類和蝦類腸道微生物的研究較多，而對(duì)河蟹腸道菌群多樣性知之甚少，近年相關(guān)研究主要集中在河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)[12-16]，以及飼料添加物，如乳鐵蛋白[17]、果膠、木聚糖[18]以及恩諾沙星和皮質(zhì)醇[19]對(duì)河蟹腸道菌群的影響等。本研究以長(zhǎng)江口抱卵前后的中華絨螯蟹雌蟹為研究對(duì)象，采用16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)研究其腸道菌群結(jié)構(gòu)，探討洄游期抱卵前后雌蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性，進(jìn)而揭示雌蟹食性與腸道菌群的相關(guān)性，從微生物菌群的角度為蟹類的養(yǎng)殖生產(chǎn)與疾病防控提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為中華絨螯蟹益生菌的開(kāi)發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

在長(zhǎng)江口崇明東灘（122°4′～122°11′E、31°20′～31°25′N）采用監(jiān)測(cè)船和刺網(wǎng)采集中華絨螯蟹，在11月采集抱卵前雌蟹，在翌年1月采集抱卵后雌蟹。選取健康活潑、大小規(guī)格相似的抱卵前雌蟹（DK組）和抱卵后雌蟹（BK組）各4只作為測(cè)定腸道微生物的樣本材料。雌蟹先用無(wú)菌水沖洗，然后采用75%乙醇對(duì)其體表進(jìn)行消毒，在超凈工作臺(tái)上解剖取出其腸道，去除腸內(nèi)容物，用無(wú)菌水輕微沖洗后，立即置于-80℃冰箱凍存，用于后期提取DNA。

1.2樣本總DNA的提取與PCR擴(kuò)增[JP3]

采用FastDNATMSpinKitForSoil（MPBiomedicals，USA）進(jìn)行樣本腸道微生物DNA的提取。DNA樣品濃度和質(zhì)量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格后稀釋至1ng/μL作為擴(kuò)增模板，使用含有barcode特異性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）來(lái)擴(kuò)增16SrRNA基因的V4區(qū)域。PCR反應(yīng)體系為20μL：PhusionMasterMix15μL，引物515F1μL，引物806R1μL，DNA模板1μL，蒸餾水2μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性1min;95℃變性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循壞;72℃退火5min，4℃保存。利用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物質(zhì)量。質(zhì)量合格后使用QiagenGelExtractionKit純化試劑盒進(jìn)行純化，使用QubitVersion@2.0（Invitrogen，USA）儀器進(jìn)行定量。隨后利用TruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit（Illumina，USA）試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建。構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后利用IlluminaHiSeqPE250平臺(tái)進(jìn)行微生物16SrRNA基因V4區(qū)的高通量測(cè)序（北京諾禾致源技術(shù)有限公司）。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用滑動(dòng)窗口法去除測(cè)序所得原始序列中的引物和標(biāo)簽，用Flash軟件根據(jù)Overlap關(guān)系對(duì)序列進(jìn)行拼接[20]，對(duì)于無(wú)法拼接的Reads數(shù)據(jù)進(jìn)行丟棄，利用Qiime軟件對(duì)上述拼接后的序列進(jìn)行過(guò)濾[21]，利用Mothur軟件中Uchime的方法把過(guò)濾后的數(shù)據(jù)嵌合體序列清除[22]，得到最終分析的有效序列。

利用Uparse軟件（Uparsev7.0.1001，http：//drive5.com/uparse/）[23]進(jìn)行OUT聚類，得到OUT代表序列。有效序列均一化處理后匹配OTU代表序列，獲得OTU聚類結(jié)果。另外，利用Mothur軟件[24]基于均一化的OUT數(shù)據(jù)得到稀釋性曲線。對(duì)OTU序列利用RDPClassifier（貝葉斯算法）進(jìn)行分類學(xué)分析，得到對(duì)應(yīng)的物種分類信息（Silva數(shù)據(jù)庫(kù)），并在各個(gè)水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。使用Muscle軟件進(jìn)行代表序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，獲得腸道微生物在不同分類水平上的分類。使用Qiime（Version1.7.0）和R軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)和β多樣性分析（主成分分析PCoA）。利用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)序深度

在IlluminaHiSeqPE250平臺(tái)對(duì)8個(gè)樣品16SrRNA基因的V4區(qū)域測(cè)序，由表1可知，經(jīng)過(guò)初步過(guò)濾后，獲得80105～80290條有效序列，有效序列中，堿基質(zhì)量值大于20的堿基占有效序列的86%以上，有效序列數(shù)目占原始序列數(shù)目90%，樣本經(jīng)過(guò)均一化后獲得有效序列以97%的相似性聚類到251個(gè)OUT上。由圖1可知，隨著序列數(shù)的增長(zhǎng)，OUT稀釋曲線趨于飽和，說(shuō)明雌蟹腸道菌群16SrRNA基因的V4區(qū)數(shù)據(jù)量可反映樣本腸道菌群的關(guān)系。

由表2可知，DK組和BK組的平均OTU數(shù)目分別為313個(gè)和376個(gè)，其中，2組共有OUT數(shù)量為201個(gè)，特有OUT數(shù)目分別為112個(gè)和175個(gè)，分別占DK和BK2組樣品OTU總數(shù)的35.78%和46.54%。

2.2雌蟹抱卵前后腸道菌群的門分布

由圖2可知，在門水平，雌蟹抱卵前后腸道核心菌群沒(méi)有發(fā)生變化（除浮酶菌門外），均為柔膜菌門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和酸桿菌門。雌蟹抱卵前和抱卵后腸道中比例最高的優(yōu)勢(shì)門都是柔膜菌門。以上5種優(yōu)勢(shì)菌門在雌蟹抱卵前腸道菌群門中占比分別為39.84%、20.12%、15.52%、8.07%和9.01%;在抱卵后腸道菌群門中占比分別為58.00%、5.12%、13.07%、9.09%和7.01%。

由圖3可知，雌蟹發(fā)育成抱卵蟹的過(guò)程中，腸道菌群中柔膜菌門、變形菌門和厚壁菌門占比在雌蟹抱卵前后具有顯著差異，變形菌門和厚壁菌門的豐度抱卵后小于抱卵前，而柔膜菌門豐度抱卵后大于抱卵前。

2.3雌蟹抱卵前后腸道菌群的屬分布

由圖4可知，雌蟹抱卵前后的主導(dǎo)菌屬為Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma，這2種菌屬在雌蟹抱卵前腸道菌屬中占比分別為26.54%和25.81%，抱卵后的占比分別為30.29%和29.05%。Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma這2個(gè)屬的豐度在雌蟹抱卵前后無(wú)顯著性差異（P>0.05）。弧菌屬（Vibrio）和氣單胞菌屬（Aeromonas）是雌蟹抱卵前后菌屬的重要組成部分，抱卵前占比分別為6.87%和8.03%;抱卵后占比分別為5.34%和7.77%。弧菌屬和氣單胞菌屬的豐度在雌蟹抱卵前后無(wú)顯著性差異（P>0.05）。乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐度抱卵后大于抱卵前（P<0.05），棍狀厭氧菌（Anaerorhabdus）的豐度抱卵后小于抱卵前（P<0.05）。除上述菌屬外，雌蟹抱卵前后的腸道菌群屬另有擬桿菌屬、Prolixibacter、未辨認(rèn)的支原體屬、Dysgonomonas等。

通過(guò)對(duì)不同樣本組腸道微生物的方差分析（A-MOVA）表明，雌蟹抱卵前后的腸道微生物的P=0.041，表明雌蟹抱卵前后的腸道菌群差異顯著（P<0.05）。

2.4樣品α和β多樣性分析

由圖5可知，對(duì)DK和BK這2組8個(gè)樣本通過(guò)NMDS-weighted（NonmetricMultidimensionalScaling，非度量多維尺度）分析可知，雌蟹抱卵前后腸道微生物群落具有明顯差異。

采用Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、辛普森指數(shù)（Simpsonindex）和香農(nóng)指數(shù)（Shannonindex）對(duì)樣本菌群的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估，由圖6可知，雌蟹在抱卵發(fā)育過(guò)程中Chao指數(shù)和ACE指數(shù)逐漸增加，表明腸道菌群豐度逐漸增加;辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定，表明腸道菌群的多樣性未發(fā)生顯著變化。

3討論

3.1雌蟹抱卵前后腸道菌群多樣性差異

生物體內(nèi)腸道微生物主要來(lái)源于周圍環(huán)境、土壤和食物[25-26]，并在生物體的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段往往會(huì)發(fā)生變化[27]。繁殖期作為生物體的關(guān)鍵時(shí)期，生物體的新陳代謝強(qiáng)度相對(duì)較高，體內(nèi)的腸道微生物亦會(huì)發(fā)生一定變化[28]。本研究結(jié)果表明，抱卵后雌蟹腸道微生物多樣性大于抱卵前（P<0.05），與暗黑鰓金龜（Holotrichiaparallela）性腺發(fā)育期腸道微生物多樣性逐漸增加的結(jié)果類似[29]，與胡亞強(qiáng)等對(duì)不同生長(zhǎng)階段團(tuán)水虱（Sphearoma）腸道微生物的研究結(jié)論[30]一致。目前，關(guān)于不同發(fā)育階段生物體腸道微生物的變動(dòng)機(jī)制仍不清楚，推測(cè)與其性激素的分泌有一定關(guān)系[31-32]。

攝食亦是影響腸道群落結(jié)構(gòu)的重要因素之一[33-34]，Munro等發(fā)現(xiàn)，魚類攝取的活餌料是其腸道菌群的主要來(lái)源[35];郝耀彤等認(rèn)為食物的改變會(huì)對(duì)草魚腸道微生物菌群產(chǎn)生快速而顯著的影響[36]。另有研究表明，雌蟹動(dòng)物性餌料占比抱卵前大于抱卵后，而藻類和水生植物占比抱卵前小于抱卵后[3]，推測(cè)本研究中抱卵前后雌蟹腸道微生物具有差異，亦與其攝食不同的餌料有關(guān)。Ley等研究發(fā)現(xiàn)，陸生動(dòng)物腸道菌群多樣性與食性有關(guān)，從肉食性、雜食性到草食性表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)[37]。而Mrazek等研究發(fā)現(xiàn)蟑螂（Nauphoetacinereaoliv）的腸道菌群多樣性大于黃蜂（Vespulavulgaris）和蜜蜂（Apismellifera），認(rèn)為昆蟲腸道菌群多樣性從草食性到雜食性逐漸增加[39]。[JP3]本研究結(jié)果與陸生動(dòng)物研究結(jié)果類似，但與昆蟲的研究結(jié)果相反，這可能是因?yàn)閿z食對(duì)腸道菌群的影響具有一定的物種特異性，[JP3]另外不同的研究取樣部位也可能對(duì)菌群組成產(chǎn)生一定影響。

3.2雌蟹抱卵前后腸道菌門差異性

在雌蟹腸道菌群的類別分析中發(fā)現(xiàn)，柔膜菌門、變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為雌蟹腸道中的核心菌群，其中，柔膜菌門是腸道中的第一優(yōu)勢(shì)菌門，這一結(jié)果與金貝等對(duì)陽(yáng)澄湖河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究[16]類似，表明柔膜菌門在其腸道中具有重要作用。柔膜菌門在腸道菌群中的占比抱卵后顯著大于抱卵前，抱卵后占比較高的原因可能與柔膜菌門是維持生物體胚胎健康生長(zhǎng)發(fā)育的微生物有關(guān)[39]。除柔膜菌門外，變形菌門和厚壁菌門是雌蟹抱卵前的優(yōu)勢(shì)菌門;厚壁菌門和擬桿菌門是抱卵后的優(yōu)勢(shì)菌門，這表明雌蟹抱卵前后的腸道菌群存在一定差異，這與變形菌門和擬桿菌門在雌蟹腸道中發(fā)揮的不同作用有關(guān)。

本研究中，雌蟹抱卵前后浮霉菌門豐度也存在一定差異，抱卵后顯著大于抱卵前。研究表明，浮霉菌門多存在于厭氧環(huán)境下，并且包含多種厭氧氨氧化細(xì)菌，底泥中相對(duì)含量較高[40]。雌蟹抱卵后浮霉菌門含量較高的原因可能與抱卵后食性有關(guān)，雌蟹抱卵后行動(dòng)能力弱，攝食種類受限，因此攝食比較多的顆粒碎屑和底泥，導(dǎo)致浮霉菌門在其腸道中比例增加。

3.3雌蟹抱卵前后腸道菌屬差異性

就屬水平而言，Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma在抱卵前后的雌蟹腸道菌群中均占較大比例，其中，Candidatus_Hepatoplasma被認(rèn)為是中華絨螯蟹雌蟹和雄蟹腸道中共有的優(yōu)勢(shì)菌[16]，揭示該菌群在中華絨螯蟹腸道內(nèi)發(fā)揮重要作用，而Candidatus_Bacilloplasma則可能是雌蟹腸道中的一種潛在優(yōu)勢(shì)菌。

棍狀厭氧細(xì)菌是一種腸桿菌，通常不會(huì)分解糖，多存在于肉食性生物腸道內(nèi)[41];乳桿菌（Lactobacillus）在食草動(dòng)物腸道內(nèi)存在較多[42]。雌蟹腸道菌群中棍狀厭氧菌的占比抱卵前大于抱卵后（P<0.05），而乳桿菌占比抱卵前小于抱卵后（P<0.05），可能是由于雌蟹抱卵后行動(dòng)力減弱，植物性餌料比重升高造成的。另外，氣單胞菌屬在雌蟹抱卵前后的腸道中廣泛存在，但由于其抗菌能力的強(qiáng)弱會(huì)根據(jù)宿主類型的不同而變化，因此氣單胞菌屬在中華絨螯蟹抗病性中是否如同在草魚中一樣發(fā)揮積極作用[43]，仍有待于進(jìn)一步研究。

4小結(jié)

長(zhǎng)江口中華絨螯蟹雌蟹腸道菌群多樣性豐富，柔膜菌門、變形菌門和厚壁菌門是其腸道的主要菌群，在雌蟹的生殖洄游期略有波動(dòng)。結(jié)合中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后食性分析結(jié)果表明，由于抱卵前后中華絨螯蟹雌蟹的攝食習(xí)性和餌料組成不同，會(huì)對(duì)其腸道微生物多樣性產(chǎn)生一定影響，但并非唯一影響因素。目前來(lái)看，菌群在雌蟹腸道中發(fā)揮的作用不是十分明確，還需深入研究。

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