氮肥添加對土壤微生物生物量及酶活性的影響

秦瑋璽　斯貴才　雷天柱　張生銀　馬建忠

摘要：選取青藏高原納木錯湖旁邊高寒草原，通過持續1年對土壤進行不同量的氮肥添加處理，對不同氮肥施加量導致的土壤的理化性質、土壤微生物生物量和土壤酶活性的變化進行研究。結果顯示：隨著氮肥施加量的增加，土壤pH值降低，土壤總氮含量升高，土壤微生物生物量大幅下降;其中，土壤微生物生物量與土壤pH值呈顯著正相關，與土壤總氮含量呈極顯著負相關;土壤中脲酶的活性與土壤總氮含量呈極顯著負相關，β-葡糖苷酶活性與pH值呈顯著正相關;蔗糖酶、蛋白酶、L-天冬酰胺酶、和過氧化物酶活性均有顯著變化。氮肥的添加改變了高寒草原土壤的理化性質和土壤微生物的生物量，可能會對高寒草原土壤的生態環境產生破壞。

關鍵詞：高寒草原;氮肥;土壤理化性質;微生物生物量;土壤酶活性

中圖分類號：S154.3文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0170-06

作者簡介：秦瑋璽（1993—），男，甘肅定西人，碩士研究生，從事抗體制備和微生物多樣性研究。E-mail：673877495@qq.com。

通信作者：馬建忠，研究員，從事植物分子生物學和抗體制備研究。E-mail：majz@lut.cn。

土壤中存在的細菌、真菌、放線菌、藻類和原生動物被統稱為土壤微生物[1-3]。土壤微生物在參與土壤系統能量轉化、元素循環等過程的同時，對土壤的理化性質也有一定影響[4]。研究高寒草原土壤中微生物生物量的變化對其生態系統的營養狀況具有重要意義。

在土壤中活動的微生物和動植物會產生大量酶進入土壤生態系統，這些酶參與土壤中各種生物化學反應過程，被定義為土壤酶。作為土壤中最基本的營養元素，土壤養分不僅維系了土壤中動植物活動，同時也影響了微生物群落和生物多樣性[5]。土壤酶是土壤養分循環最直接的驅動力[6-7]。因此，土壤中酶的活性可以視為土壤肥力的重要指標。

氮元素是合成氨基酸的必要元素，因此，所有生物生長發育都需要大量的氮元素。在人類工業革命之前，生物圈氮元素維持一個微妙的平衡，但自從人工固氮技術成熟并應用于農業生產之后，大量外源氮輸入生態圈，使土壤的理化性質和養分度產生變化，進而影響動植物群落的分布和微生物生物量[7-8]。

青藏高原草場面積廣闊，約1.4億hm2，主體為高寒草原，大部分草場都遠離人類工業活動和農耕[9]。本試驗主要在納木錯湖周邊高寒草原完成，研究在梯度施加氮肥的情況下，土壤理化性質的變化以及外源氮輸入時微生物生物量和酶活性變化的趨勢，以期發現氮肥添加導致的高寒草原土壤變化特征，為預測農業生產導致的生態環境變化提供理論依據。[LM]

1材料與方法

1.1研究區概況

本試驗地點位于青藏高原納木錯湖附近高寒草原（30°46.44′N、90°59.31′E，海拔4730m），該地區屬于典型的半干旱高原季風氣候區，年平均氣溫為-0.6℃，平均氣壓為571.2hPa，大部分降水集中在5—9月。

1.2試驗設計與樣品采集

試驗時間為2016年8月，選取地勢平坦、植被均勻且無牧民放牧的草場區域作為試驗用地，去除牛羊糞便，確保無任何外源氮輸入。增氮試驗為期1年，氮肥選用尿素，含氮量約為46.4%。分為6個小組對土壤進行梯度增氮處理，增氮水平如下：對照N0[0kg/（hm2·年）]、N10[10kg/（hm2·年）]、N20[20kg/（hm2·年）]、N40[40kg/（hm2·年）]、N80[80kg/（hm2·年）]、N160[160kg/（hm2·年）]。

1年后于晴天采集樣品，選擇植物均勻地塊，采集表層土壤（0～10cm）作為試驗樣品，每組采集3個重復，共計18個土樣。采集完成后，過篩去除植物根絲和石子，然后每個樣品分為2份，一份用于測定土壤理化性質，保存于-20℃冰箱，另一份用于測定土壤微生物生物量以及酶活性，保存在-80℃條件下。

1.3測定與分析方法

1.3.1土壤理化性質測定本研究采用常規分析方法測定土壤理化性質。將保存在-20℃冰箱中的土壤樣品取出，放置至室溫后稱取5g于稱量瓶中，然后在烘箱中105℃烘至完全干燥，稱質量并算出土壤含水量。取10g土樣溶于25mL超純水中，用pH計測定土壤pH值，每個樣品測3次取平均值。土壤粒徑使用粒度分析儀測定。將風干后的土樣研磨至100目，用日本TOC-TN分析儀檢測土壤有機碳含量。鉬抗比色法測定土壤全磷含量。凱氏定氮儀法測量土壤總氮含量。

1.3.2土壤微生物量的測定微生物生物量的測定使用磷脂脂肪酸（PLFA）法測定，使用修改后的BD方法[12]，以磷脂脂肪酸的質量摩爾濃度計。稱取5g土壤，冷凍干燥處理，后用精制后的三氯甲烷5mL、甲醇10mL和磷酸鹽緩沖液4mL抽提2h，振蕩充分后離心取上清液。然后加入水和三氯甲烷（1∶[KG-*3]1），靜置10min至溶液明顯分層，吸取下層有機相，重復此步驟2次。將上述步驟得到的有機溶液過親和色譜柱，流動相分別為三氯甲烷、丙酮和甲醇，其中甲醇洗脫得到磷脂。在磷脂中加入KOH溶液，于37℃條件下水浴15min讓磷脂水解為磷脂脂肪酸甲酯。PLFA分析采用美國Agilent6890A型氣相色譜儀，鑒定采用美國MIDI公司的SherlockMIS4.5系統。

1.3.3土壤酶活性的測定土壤酶活性測定采用關松蔭等的方法[13]。L-天冬酰胺酶活性測定：用天冬酰胺作為底物測定酶活性，在分析天平上稱取10g濕土樣品置于100mL燒杯中，加入1mL的甲苯于土壤樣品中，然后靜置20min，之后在燒杯中加入20mL的3%天冬酰胺和20mL（pH值=6.7）PBS緩沖液，將樣品和底物的混合物置于37℃條件下反應24h。蔗糖酶活性測定：稱取2g土壤樣品加入到30mL的醋酸緩沖溶液（2mol/L）中，振蕩混勻，然后加入30mL蔗糖溶液（1.2%）作為底物，最后將酶和底物置于50℃培養箱中反應3h。β-葡萄糖苷酶活性測定：取1g濕土樣品于10mL燒杯中，然后加入4mL0.05mol/L緩沖液，放置5min后，加入1mL5mmol/L對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）溶液并混勻，之后在37℃條件下水浴1h。脲酶活性測定：用尿素作為底物測定酶活性，在20mL三角錐瓶中加入2g濕土樣品和10mL的尿素溶液（80mmol/L），然后37℃水浴2h即可。蛋白酶活性測定：稱取2g濕土樣品于30mL燒杯中，然后依次加入10mL三異丙基乙磺酰緩沖溶液和10mL酪蛋白底物溶液，50℃下反應2h。酚氧化酶和過氧化物酶活性采用分光光度法測量：以1%焦培酸作為酶底物，稱取2g濕土樣品加入到10mL底物溶液中，30℃條件下反應10min。酸性磷酸酶活性測定：用苯基磷酸鹽作基質，以酚的釋放量表示磷酸酶活性。

1.3.4統計學分析方法本研究所有統計學分析均在軟件SPSS21.0上完成。其中，顯著性差異采用單因素方差和多重比較進行分析。相關性分析采用皮爾森相關分析方法。顯著性水平α=0.05。

2結果與分析

2.1不同氮肥處理土壤理化性質的變化

試驗地的部分理化性質隨著氮肥施加量的增加有一定變化（表1）。其中，N10、N80和N160處理的土壤總氮含量隨著氮肥施加量的增加而顯著上升（P<0.05），在沒有氮肥的情況下土壤總氮約為2.28g/kg，而在施肥量為160kg/（hm2·年）的條件下，土壤總氮含量增加到2.78g/kg。土壤含水量和土壤全磷含量在各個氮肥處理之間沒有明顯變化。土壤碳氮比因為土壤總氮的上升而出現下降，在沒有氮肥的情況下土壤碳氮比為23.47，而在施肥量為160kg/（hm2·年）的條件下下降為20.05，且呈現波動降低的變化趨勢（P<0.05）。土壤pH值在N10、N20、N40和N80處理下均沒有出現顯著變化，但N160處理與N0相比顯著降低。

2.2土壤酶活性的變化

本研究共探討了8種土壤酶活性隨氮肥施加量變化而變化的結果，酚氧化酶（phenoloxidase）、L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）和堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）活性并沒有隨氮肥施加量的增加而呈現顯著的變化趨勢，其中過氧化物酶、L-天冬酰胺酶和蛋白酶在施肥量為10kg/（hm2·年）的條件下活性達到最大值，相比沒有施肥處理的土壤有所升高，但隨著氮肥施加量的增加，這幾種酶活性又出現下降趨勢（圖1）。蔗糖酶（invertase）活性隨氮肥施加量的增加呈現先上升后下降的趨勢，在N40處理條件下達到最大值2.48μg/（g·h）。β-葡糖苷酶（β-glucosidase）活性在前4個處理和對照沒有明顯變化，但N160處理[JP3]活性顯著升高（P<0.05），達到335.3μg/（g·h）。與對照相比，N10處理的過氧化物酶（peroxidase）活性顯著升高，而N20、N40處理顯著降低;N10處理的蛋白酶（protease）活性顯著升高，而N80處理顯著降低（表2）。脲酶（urease）可以水解尿素，其活性代表了土壤水解氮肥的能力，本研究中脲酶活性隨著氮肥施加量的增加顯著升高（P<0.05，圖1）。

2.3微生物生物量的變化趨勢

本研究高寒草原土壤總微生物生物量用磷脂脂肪酸量來表示（C16：0，10Me16：0，i17：0，17：0anteiso，17：1ω8c，cy17：0、C17：0，10Me17：0，18：1ω7c，18：1ω5c，C18：0）。高寒草原土壤在1年的增氮處理后，微生物生物量顯著下降，由不加氮肥處理時的92.48nmol/g下降至N160處理的48.93nmol/g，且隨著氮肥施加量的增加，生物量逐步呈現明顯下降的趨勢（P<0.05，圖2）。其中，N20到N80處理間生物量的下降趨勢較緩。對照N0到N10處理間下降較為明顯。N80到N160處理的下降幅度最大，N160處理生物量與CK相比減少43.55nmol/g。

2.4土壤酶活性與生物量和土壤理化性質之間的相關性

由表3可知，高寒草原土壤微生物生物量與土

[FK（W10][TPQWX2.TIF][FK）]

壤pH值呈顯著正相關，相關系數為0.85（P<0.05），與土壤總氮含量呈極顯著負相關（r=-0.95，P<0.01）;與含水量、全磷（TP）含量、總有機碳（TOC）含量、總無機碳（TC）含量以及土壤粒徑之間沒有顯著的相關性（P>0.05）。

3討論

土壤的理化性質與微生物生物量和酶活性密切相關[14]。通過分析添加不同氮肥施加量對土壤理化性質的影響（表1）可以發現，土壤pH值在N160處理下有顯著下降，周細紅等的研究表明，尿素在土壤中水解會消耗H+，導致增氮處理前期土壤pH值會有所升高，而之后銨根離子轉化為硝酸根和亞硝酸根的過程會產生大量的H+，因此土壤pH值會快速下降[15]。之前的研究表明，土壤pH值是影響微生物生長繁殖的重要因素，相較于其他因素，土壤微生物對pH值的變化非常敏感，pH值越低，微生物生物量越低，即pH值與微生物生物量呈顯著性正相關（r=0.848，P<0.05）[16]，這與本試驗結果一致。在本試驗結果（表1）中可以看到，土壤總氮含量隨氮肥施加量的增加而顯著升高。從表3可以看到，土壤總氮含量與微生物生物量也有顯著相關性（r=-0.952，P<0.01），隨著土壤氮含量的升高，微生物生物量顯著下降（圖2），裴雪霞等也發現了類似的規律[17]。結合本試驗結果與Jenkinson等的結論[18]推測，施加氮肥會導致土壤pH值降低，而酸性土壤不利于微生物生長，這是導致微生物生物量降低的主要原因。土壤水含量、全磷含量、總有機碳含量、總無機碳含量和土壤粒徑在增氮處理下皆沒有顯著性變化，且這些指標與微生物生物量的變化沒有顯著性差異（表1、表4）。

土壤酶活性與土壤肥力和土壤生態環境息息相關[19-21]。由圖1可以看到，β-葡糖苷酶在氮肥添加量增多的情況下活性有下降趨勢，活性由對照的275.35μg/（g·h）增加到335.32μg/（g·h）（表2），β-葡糖苷酶參與了土壤環境中的碳循環[22]，然而試驗結果表明各處理之間的有機碳（TOC）含量并沒有顯著性差異（表1），這與之前的研究矛盾。但通過表4可以看到，β-葡糖苷酶的活性與土壤pH值有顯著的相關性，因此可以將β-葡糖苷酶活性的降低可以解釋為因氮肥施加導致的pH值降低，進而影響酶的活性。蔗糖酶、過氧化物酶和蛋白酶活性在氮肥增加的過程中都有先上升后下降的趨勢（圖1），說明在一定范圍內，氮肥的增加可以激活這幾種酶的活性，但隨著氮肥施加量的進一步升高，酶活性會被抑制，其中的機理有待進一步研究。脲酶可以催化尿素將尿素水解并產生氨，氨可以被植物吸收利用，直接參與土壤氮循環，因此脲酶活性的變化會對土壤環境產生一定影響[23-25]。在本研究中，相對于其他2種參與氮循環的土壤酶（L-天冬酰胺酶和蛋白酶），脲酶活性隨土壤總氮含量變化表現為極顯著差異（r=0.99，P<0.01），且脲酶活性隨著氮肥施加量的增加而顯著增加（圖2）。蔗糖酶和L-天冬酰胺酶與土壤粒徑變化有顯著相關性（表4），2種酶都與沙土占比呈極顯著正相關，而與粉土呈極顯著負相關（P<0.01），說明這2種酶活性對土壤粒徑的變化敏感且在沙土中有更好的活性。綜上所述，施加氮肥對植物和微生物會深刻影響氮源和碳源的利用方式，導致土壤環境產生變化。

4結論

本研究表明，隨著在青藏高原高寒草原中氮肥施加量的增多，土壤碳氮比降低，土壤pH值下降，土壤微生物生物量會有顯著下降，β-葡糖苷酶、蔗糖酶、蛋白酶、過氧化物酶以及脲酶的活性也會因氮肥施加量的不同而產生變化。氮肥的添加改變了高寒草原土壤的理化性質和土壤微生物的生物量，可能會對高寒草原土壤的生態環境產生破壞。

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