黃瓜發育早期耐旱突變體篩選與鑒定

陳皓煒　劉志宇　安宇寧　王茹　宋蒙飛　陳潔　婁群峰

摘要：以863份黃瓜突變體和長春密刺野生型為材料，進行PEG-6000溶液（200g/kg）模擬干旱發芽試驗，通過比較發芽勢、相對發芽率并綜合胚根生長情況，初步篩選得到耐旱材料，再對篩選出的材料和野生型材料長春密刺進行苗期干旱（PEG-6000，200g/kg）處理，并測定形態指標和生理指標，綜合比較篩選得到耐旱新材料。結果表明，干旱發芽試驗下，初步得到11份耐旱突變體材料。幼苗期干旱脅迫處理下11份突變體材料與長春密刺野生型各項形態指標和生理指標都呈現不同程度的變化，株高、莖粗和地下鮮質量均降低，而超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量及可溶性蛋白質含量上升。隸屬函數法比較篩選得到7份高耐旱新材料。

關鍵詞：黃瓜;發育早期;突變體;耐旱;篩選;鑒定

中圖分類號：S642.201文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0112-06

作者簡介：陳皓煒（1999—），男，浙江義烏人，主要從事葫蘆科作物遺傳育種與種質創新研究。E-mail：2629015119@qq.com。

通信作者：婁群峰，博士，教授，主要從事葫蘆科作物遺傳育種與種質創新研究。E-mail：qflou@njau.edu.cn。

干旱是世界性的主要自然災害之一，占所有非生物危害的首位，是限制植物生長發育和產量的重要環境因素[1]。干旱半干旱區約占全球陸地總面積的30%，我國干旱半干旱區約占國土面積的40%[2]，而根據模型預測，隨著氣候變化的加劇，干旱區的面積還將繼續擴大[3]。此外，季節性干旱還時常影響我國非干旱的主要農業地區，如何提高農作物的耐旱性一直是研究的熱點[4]。

黃瓜（CucumissativusL.）是世界性的重要蔬菜作物，我國黃瓜種植面積約126.67萬hm2，占世界黃瓜栽培面積的60%，年產量達6487萬t，規模和年產量都位居世界第一[5-6]。黃瓜根系較淺，且葉片大，耗水量大，生長發育對于水分的要求高，干旱極易影響黃瓜的生長發育、果實品質和產量[7]。

黃瓜優質材料篩選已在耐鹽、低溫、高溫等耐逆方面得到實現，而耐旱方面研究仍集中于黃瓜生理指標對干旱的響應[8-13]，對耐旱黃瓜種質選育的相關研究較少，現有黃瓜耐旱種質資源缺乏。同時，黃瓜遺傳背景狹窄，現有可用來表型篩選的種植資源缺乏，而EMS（甲基磺酸乙酯）誘變突變體庫為篩選目標材料提供了豐富的資源，可作為本研究的篩選源[14-15]。但用常規方法對植株苗期形態和生理指標鑒定來篩選耐旱材料在本研究需要花費大量的人力和時間，因此簡便有效的篩選方法顯得十分必要[16]。種子萌發期篩選操作簡單且周期較短，可快速過濾大量耐旱性較差的材料，縮小篩選范圍，苗期則對粗篩出的材料進一步篩選，得到較可靠的優質耐旱材料。

研究表明，干旱脅迫會抑制種子對水分的吸收，從而使細胞喪失膨壓，種子生活力下降，影響種子中與碳氮代謝相關酶的活性及其代謝產物，進而顯著抑制種子的萌發[17]。由于缺乏水分，植株在營養生長過程中表現為地下鮮質量變小、株高和莖粗下降，不利于后期的生殖生長[18]。此外，干旱導致外界環境擁有較大的滲透壓，植物細胞失水，導致可溶性蛋白和脯氨酸含量上升[19];且干旱會導致細胞膜氧化，引起超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛含量上升[20]。由于植株耐旱性是多項生理指標共同作用的結果，以某一指標的結果判斷材料耐旱性過于片面，且無法對所有參試材料的耐旱性進行合理的定量比較，隸屬函數正好可將互相獨立的數值轉換成綜合指標，減小單個指標存在的片面性和誤差，增強評價的說服力[21]。

本研究利用聚乙二醇6000（PEG-6000）模擬干旱對黃瓜甲基磺酸乙酯（EMS）突變體庫材料進行萌發試驗篩選耐旱突變體材料，再分析鹽脅迫下耐旱突變體材料的形態和生理指標特征，利用平均隸屬函數值綜合評價不同材料耐旱性，篩選出高耐優良材料，并闡明黃瓜耐旱生理機制，為黃瓜耐旱的品種選育提供優良材料，同時為耐旱生理機制的進一步研究提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料與處理

本試驗使用的材料由南京農業大學葫蘆科作物遺傳與種質創新實驗室提供。前期已獲得用EMS誘變處理的華北型黃瓜材料長春密刺，自交3代獲得突變體庫。試驗于2019年5—11月于南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室進行。

取上述的863份突變體材料進行編號，每個編號取5粒飽滿整齊的種子，用清水沖洗后放入裝有55℃清水的紙杯中浸泡4h，將種子取出吸去多余的水，放入墊有2層濾紙的培養皿中，加入20mL的200g/kgPEG-6000溶液，置于光培箱中黑暗發芽，溫度為（28±1）℃，重復3次。以胚根突破種皮2mm為準，分別于2d后統計種子發芽數，4d后統計種子發芽數、胚根長度，最后計算出各個編號種子的發芽率、發芽勢、相對發芽率。根據種子的各項發芽指標，對比篩選出耐旱型、中間型、旱敏型3種突變體材料。

將發芽期初步篩選出來的耐旱材料和長春密刺野生型進行浸種催芽，待種子出芽后，播入挖有小孔的泡沫板，放入裝有清水的塑料盤中進行水培，每天更換清水。在幼苗的子葉展開后，換用1/2Hogland營養液水培;待幼苗長至3葉1心后，每份材料挑選12株長勢整齊一致的黃瓜苗平均分為2組：處理組和對照組;處理組營養液中加入一定量的PEG-6000使之濃度達到100g/kg，預處理1d，再加PEG-6000使其濃度達到200g/kg，處理2d后測定植株形態指標和葉片生理指標，每個指標設3個重復。

1.2測定指標與方法

1.2.1發芽指標發芽勢=2d后種子發芽數/供試種子數×100%;發芽率=4d后種子發芽數/供試種子數×100%;相對發芽率=供試種子發芽率-對照長春密刺種子發芽率。

1.2.2形態指標用游標卡尺于子葉部位向下0.5cm處測量莖粗（mm）;用直尺測量從泡沫板表面到幼苗最高生長點部位的距離（cm）;將幼苗在泡沫板以下的地下部與植株分離，用吸水紙吸干表面殘留的營養液，電子天平稱地下部鮮質量（g）。

1.2.3生理指標超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍四唑（NBT）還原法[22]測定;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[23]測定;脯氨酸（Pro）測定采用酸性茚三酮法[24]進行;可溶性蛋白質含量用考馬斯亮藍法[25]測定。

1.2.4隸屬函數值模糊集合中的隸屬函數，可將互相獨立的數值轉換成1個綜合的指標，現在綜合評判耐逆性常用此方法。

耐旱性隸屬函數值算法如下：

若測得指標與耐旱性正相關，則U=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）;

若測得指標與耐旱性負相關，則U=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）。

式中：X表示某指標的一個測定值;Xmin為該指標測定值中的最小值;Xmax為該指標測定值中的最大值;U表示指標該測定值的隸屬函數值。計算各指標隸屬函數值的均值，均值越大，則表明耐旱性越強。

1.3數據處理

數據處理分析采用Excel2016和SPSS25.0軟件，顯著水平α=0.05。

2結果與分析

2.1發芽期黃瓜耐旱突變體材料的篩選

對863份黃瓜突變體材料進行發芽指標統計，數據顯示，不同編號種子之間發芽指標差異較為顯著。絕大部分突變體材料發芽指標弱于或近似長春密刺野生型（發芽率17.7%），發芽率低甚至為0、胚根很短甚至不生長，表明這些材料耐旱性較差;少部分材料表現出發芽指標顯著優于野生型，大部分發芽甚至全發芽、胚根長度較長。根據相對發芽率將所有材料分為耐旱型、中間型和旱敏型3種材料（表1），其中旱敏型相對發芽率小于20%，數量最多，有591份，占總材料數的68.48%;中間型相對發芽率為20%～80%，有250份，占總材料數的28.97%;耐旱型相對發芽率大于80%，僅有22份，占總材料數的2.55%。

根據這22份材料種子的發芽指標，以高發芽勢、發芽率和較長胚根長度，從中選出11份表現優異的材料進行下一步鑒定（表2）。

2.2幼苗期黃瓜耐旱材料的鑒定

2.2.1形態指標鑒定干旱脅迫下11份黃瓜突變體材料和長春密刺野生型在各個形態指標上均呈現不同程度的下降（表3）。除Mu-18-12和野生型外，其余材料的株高在干旱處理和對照間均無顯著差異，且共6份材料（Mu-119-6、Mu-18-12、Mu-175-1、Mu-118-5、Mu-47-13、Mu-31-11）株高降低的百分比（5.35%、9.06%、9.25%、9.69%、10.51%、10.53%）小于野生型（11.43%）;僅Mu-33-6和Mu-109-10這2份材料的莖粗在干旱和對照間無顯著差異，且7份材料（Mu-118-5、Mu-170-10、Mu-109-10、Mu-33-6、Mu-18-12、Mu-31-10、Mu-31-11）莖粗降低的百分比（4.32%、5.82%、7.57%、7.86%、8.97%、9.05%、9.05%）小于野生型（10.14%）;在干旱處理和對照間，除Mu-31-11、Mu-67-1和野生型外，其余材料的地下鮮質量無顯著差異，且6份材料（Mu-118-5、Mu-170-10、Mu-119-6、Mu-175-1、Mu-67-1、Mu-31-11）地下鮮質量降低的百分比（11.35%、14.95%、18.18%、19.66%、20.00%、20.18%）小于野生型（20.47%）。

2.2.2可溶性蛋白含量鑒定干旱脅迫使12份材料的可溶性蛋白含量均呈現不同程度的上升趨勢（圖1），除Mu-109-10外，其余材料在干旱和對照之間的可溶性蛋白含量均存在顯著差異。其中，4份材料（Mu-31-10、Mu-119-6、Mu-67-1、Mu-118-5）的可溶性蛋白上升的百分比（48.55%、44.33%、43.35%、42.86%）大于野生型（41.42%）。

2.2.3SOD活性鑒定干旱脅迫能顯著提高黃瓜幼苗的超氧化物歧化酶（SOD）活性（圖2），每份材料的SOD活性均與對照有顯著差異。其中，6份突變體（Mu-31-11、Mu-109-1、Mu-47-13、Mu-118-5、Mu-33-6、Mu-67-1）的SOD活性上升百分比（104.07%、86.58%、83.79%、84.14%、82.51%、79.87%）大于野生型（77.43%）。

2.2.4脯氨酸含量鑒定干旱導致不同材料的脯氨酸含量上升（圖3），除Mu-119-6以外，每份材料的脯氨酸含量在干旱脅迫和對照間均存在顯著差異，其中2份材料（Mu-118-5、Mu-31-10）的脯氨酸含量上升百分比（460.00%、412.50%）大于野生型（402.17%）。

2.2.5丙二醛含量鑒定干旱使不同材料的丙二醛含量呈現不同程度的上升（圖4），除Mu-119-6、Mu-47-13和Mu-170-10以外，其他材料的丙二醛含量在干旱脅迫和對照間均存在顯著差異。突變體中有9份材料（Mu-170-10、Mu-47-13、Mu-67-1、Mu-119-6、Mu-31-10、Mu-118-5、Mu-175-1、Mu-33-6、Mu-31-11）的丙二醛含量上升百分比（13.60%、13.29%、14.42%、16.04%、25.67%、36.92%、39.39%、45.79%、47.68%）小于野生型（54.87%）。

2.3黃瓜耐旱突變體篩選結果鑒定

部分突變體在不同指標表現差異較大，而單一指標無法評判植株的耐旱性，同時不同突變體在正常生長環境下同一生理指標的結果也不盡相同，若直接取干旱脅迫下的指標進行隸屬函數值計算，不可避免地存在起始誤差，筆者利用鹽脅迫下同一時期黃瓜幼苗不同指標上升/下降百分比的隸屬函數值的平均值來綜合評價不同材料的耐旱性，最終得到12份突變體和長春密刺野生型材料的耐旱性隸屬函數值（表4），以長春密刺野生型的表現為分界，根據平均隸屬度最終篩選出7份優質耐旱材料，即Mu-118-5、Mu-119-6、Mu-170-10、Mu-67-1、Mu-31-11、Mu-33-6和Mu-47-13，與上述分析結果基本保持一致。

3討論

干旱嚴重影響種子萌發、植株的形態結構和生理生化[26-27]。種子的發芽指標和胚根長度可直接反映其對逆境的耐受性，且操作簡單、試驗周期短，適合大批量的種子篩選試驗。聚乙二醇6000（PEG-6000）是不能透過細胞壁的一類大分子滲透調節物，其對細胞毒性小[13]。本試驗選用200g/kg聚乙二醇6000模擬干旱環境進行萌發試驗，篩選得到11份相對耐旱材料，僅占供試材料的1.27%，表明黃瓜EMS突變體中僅有極少數突變體擁有較好的耐旱性，而絕大部分材料耐旱性較差。

由形態指標結果可見，12份材料在干旱脅迫后指標都下降，但下降比例較小，且不同材料之間差異也較小，形態指標雖能在一定程度上反映植株受干旱危害的程度，但由于形態指標屬于表型，不只受種質本身調控，也受外界各種環境影響，再加上處理前后指標變化幅度不大，所得結果容易存在誤差，但大體指向仍有參考價值，此時需要內部生理指標來進一步補充。

可溶性蛋白和脯氨酸是植物細胞中的滲透調節物質，在干旱脅迫下大量積累，降低細胞滲透勢，促進細胞在干旱環境下吸收外界的水分，以維持細胞正常的形態結構[28]，12份材料的可溶性蛋白呈現10%～50%的增幅，其中增幅為40%～50%的材料耐旱性較好。參試材料脯氨酸含量均呈現成倍增長，甚至有2份材料出現4倍以上的增幅，表明其擁有較強滲透調節能力和耐旱性。除此以外，所有材料在干旱下SOD活性都有40%～100%的顯著提高，研究表明，干旱下細胞膜脂過氧化，產生大量的活性氧，而SOD是植物細胞重要的耐氧化酶，在接收到活性氧大量增加的信號后，耐氧化系統中SOD活性增強，清除過量的活性氧，緩解干旱可能造成的膜損傷[29]，SOD活性越高，說明對干旱脅迫的調節能力越強。SOD雖然可以緩解膜損傷，但在較強的干旱脅迫下，SOD不足以清除所有增加的活性氧，導致細胞膜過氧化、MDA合成增加，故MDA含量是評價細胞膜受損傷程度的指標[30]，MDA含量增幅越小，說明細胞膜受損程度越小，植株耐旱性越強，故突變體中9份MDA含量增幅小于野生型的材料擁有較強的耐旱性。綜上所述，可溶性蛋白、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性與黃瓜幼苗耐旱性呈正相關，而MDA含量與耐旱性呈負相關。

本研究以PEG處理模擬干旱，通過發芽期+苗期的篩選形式對長春密刺黃瓜突變體材料進行耐旱性評價，最終由形態和生理指標的平均隸屬度篩選得到7份優質耐旱材料：Mu-118-5、Mu-119-6、Mu-170-10、Mu-67-1、Mu-31-11、Mu-33-6和Mu-47-13，研究結果為后續黃瓜耐旱種質的選育和耐旱機制的深入研究提供理論指導。

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