基于NGS方法的基因檢測分析肺癌患者治療前后的基因變化

蔣茂芬 劉春姣 洪海華

[摘要] 目的 基于NGS方法的基因檢測分析肺癌患者的基因變化，以探討NGS方法的檢測對于肺癌患者臨床診斷的應用價值。 方法 選取2017年1月至2018年12月到我院進行診斷并住院治療的76例初治肺癌患者作為研究對象，收集其治療前后的臨床資料，分析其NGS方法的基因檢測結果。 結果 76例肺癌患者在治療前及治療后通過NGS方法檢測出的基因位點突變的基因型中EGFR基因均具有最高的突變陽性率;治療前76例患者中有58例患者存在基因位點突變，基因位點突變共計68個，治療后之前的58例基因位點突變患者僅18例患者存在基因位點突變，基因位點突變共計28個;基因突變主要以EGFR、 KRAS 和MET為主;治療后患者的例數下降，基因位點突變數由于不良反應上升，基因位點突變數與患者例數比率增加，但是整體患者例數呈下降趨勢，提示病情改善患者增加，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 NGS基因檢測技術在肺癌基因檢測中具有獨特的優勢，可應用于單細胞和游離的循環DNA，可對從組織樣本、胸水細胞蠟塊、血液樣本等多個樣本類型中獲取的DNA樣本進行準確的基因測序與檢測，具有極高的靈敏度與特異性，能夠推動對腫瘤基因突變的基礎和臨床研究，降低檢測的經濟成本，使其能夠實現在肺癌患者的臨床診斷和治療中的推廣應用。

[關鍵詞] 肺癌;NGS;基因檢測分析;基因變化;肺癌患者;基因未變突變

[Abstract] Objective To explore the application value of NGS method in clinical diagnosis of patients with lung cancer by gene detection and analysis of the genetic changes of lung cancer patients based on NGS method. Methods Among the patients diagnosed and hospitalized in our hospital from January 2017 to December 2018， 76 patients with newly treated lung cancer were selected as objects of the research， and the clinical data before and after treatment were collected to analyze the genetic test results of the NGS method. Results The EGFR gene has the highest mutation positive rate among the genotypes of gene locus mutations detected by NGS method before and after treatment in 76 patients with lung cancer; of the 76 patients before treatment， 58 patients had gene locus mutations， a total of 68 gene locus mutations， and after treatment， only 18 patients had gene locus mutations in 58 patients with gene locus mutations， a total of 28 gene locus mutations; gene mutations are mainly EGFR， KRAS and MET; after treatment， the number of patients decreased， the number of gene locus mutations increased due to adverse reactions， and the ratio of the number of gene locus mutations to the number of patients increased， but the overall number of patients showed a downward trend， indicating that the number of patients with improved condition increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion NGS gene detection technology has unique advantages in lung cancer gene detection. It can be applied to single cells and free circulating DNA， and be used for accurate gene sequencing and detection of DNA samples obtained from tissue samples， pleural effusion cell wax blocks， blood samples and other samples. With extremely high sensitivity and specificity， it can promote basic and clinical research on tumor gene mutations and reduce the economic cost of detection， which is therefore worthy of wide application in the clinical diagnosis and treatment of patients with lung cancer.

[Key words] Lung cancer; NGS; Gene detection and analysis; Genetic changes; Patients with lung cancer; No genemutations

肺癌是起源于支氣管黏膜、腺體或肺泡上皮的肺部惡性腫瘤。最近50年來，肺癌的發病率顯著增高，尤其是在歐美工業發達的國家和我國的一些工業大城市[1]。目前肺癌的發病率在男性惡性腫瘤中已居首位，女性發病率也迅速增高，占女性常見惡性腫瘤的第2位或第3位[2]。肺癌已成為危害生命健康的主要疾病之一。隨著醫學領域生物工程技術的飛速發展，人們對于肺癌發病機制的不斷探索，治療肺癌已經走向靶向治療等精準治療的時代[3]。作為一項重要的實驗技術，DNA測序（脫氧核糖核酸測序）在生物學研究中具有廣泛的應用[4]。英國生物化學家Frederick Sanger和美國生物化學家Walter Gilbert于1980年共同推出了DNA測序技術，并獲得了諾貝爾化學獎[5]。在過去的30年中，DNA測序技術取得了飛速的進步。DNA測序技術極大地支持了分子生物學的發展，是分子生物學中最常用的研究技術之一。Sanger的測序方法具有一定的局限性，依賴于電泳分離技術，無法進一步擴展和小型化。因此無法擴展基因組序列的測序程序，另一方面，這種順序方法的成本非常昂貴[6]。近年來，由于測序技術的飛速發展，許多下一代測序技術應運而生，在過去，它也創造了使用大量勞動和材料密集型序列的許多方法的歷史。ABI的第二代基于SOLID的測序和測序技術相繼問世，這開啟了大規模測序時代的帷幕。下一代測序技術是一種高性能的測序技術，這是對傳統測序技術的革命性改進。同時，高通量測序技術（NGS）可一次對數百萬甚至數千萬個DNA序列進行測序，從而獲得了總體成功[7]。NGS的基本原理是邊合成邊測序，即在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創新，用不同顏色的熒光標記四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息[8]。本研究通過對76例肺癌患者NGS基因檢測，分析其檢測結果的差異性，以探討NGS檢測對于治療肺癌的臨床應用價值，并為將來肺癌的臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月至2018年12月到我院進行診斷并住院治療的76例患者作為研究對象，其中，男47例，女29例，年齡42～85歲，平均61.41歲。13例患者存在肺部腫瘤家族病史，63例患者不存在肺部腫瘤家族史。本研究已取得本院醫學倫理委員會批準。

1.1.1 納入標準? ①年齡18～70歲，男女均可;②患者參與研究前均未采取任何放化療治療;③患者的肺部腫瘤根據《肺癌規范化診治指南》已經過臨床病理確診，且所有患者具有可以測量的病灶區域，主要臟器功能基本正常;④患者均具有明確的基因檢測標本類型，例如腫瘤原發組織、轉移灶組織、胸水、外周血等，采集組織標本主要來源于原發腫瘤、轉移淋巴結、胸膜、胸水細胞蠟塊;⑤受試者自愿加入本研究，簽署知情同意書，配合隨訪。

1.1.2 排除標準? 符合下列條件之一者將不得入選本試驗：①不能或不愿意遵從研究方案中的各項要求;②處于孕期、哺乳期的患者（育齡婦女需檢查妊娠試驗）;③處于急性傳染病或慢性傳染病活動期;④有明確藥物過敏史或屬過敏體質者;⑤不愿意提供手術組織進行檢測的患者;⑥跟蹤監測結果評價顯示不再需要繼續檢測;⑦研究者認為患者不宜參加本試驗的其他情況。

1.1.3 診斷標準? 參照《肺癌規范化診治指南（2011年版）》原發性肺癌診斷標準對患者進行診斷;依據國際肺癌研究協會（IASLC）2009年第7版分期標準進行分期;病理類型參照2015版世界衛生組織肺癌組織學分類標準進行分組[4]。

1.2方法

1.2.1 治療方法? 采用吉西他濱和鉑類方案治療鱗癌;采用培美曲塞和鉑類方案治療腺癌;對EGFR/ALK（Epidermal growth factor receptor/Anaplastic lymphoma kinase）陽性突變的晚期或轉移性腺癌患者口服表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），直至疾病進展或發生不可耐受的毒副作用停用[9]。

1.2.2 基因檢測? 分別在治療前及治療后對76例患者進行NGS基因檢測。（1）血液樣本：無法獲得組織樣本的患者，收集血液樣本。（2）組織樣本：組織樣本進行石蠟包埋并按照1×1 cm2切片，厚度控制在5～10 μm，將切片樣本置于1.5 mL并裝有1 mL二甲苯的無菌離心管中進行渦旋處理，持續10 s。按照12 000轉/min的速度在室溫環境中進行離心處理，持續2 min，丟棄上層清液。在離心管中加入1 mL的無水乙醇并進行渦旋處理，持續10 s。按以上參數重復離心步驟，丟棄上層清液并在室溫環境中靜置，以便乙醇完全揮發，10 min后加入200 μL的GA（磷酸緩沖液型號）緩沖液以及20 μL的蛋白酶K，充分混勻后在56℃的條件下孵育，持續1 h至樣本完全裂解。在90℃的條件下孵育1 h。在樣品中加入2 μL濃度為100 mg/mL的核糖核酸酶（ribonuclease，RNaseA），并在室溫條件下孵育2 min，加入220 μL的GB（磷酸緩沖液型號）緩沖液并進行渦旋混勻，加入250 μL無水乙醇并進行渦旋處理，充分震蕩混勻后，短暫離心使管壁上的溶液收集到管底。將混合液加入一個吸附柱CR2（吸附柱國標型號）中，按照8000轉/min的速度在室溫條件下進行離心處理，持續2 min，倒掉廢液，重新將吸附柱放回收集管中。加入500 μL GD緩沖液（磷酸緩沖鹽溶液中的一種型號）按照8000轉/min的速度在室溫條件下進行離心處理，持續60 s后倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。加入600 μL的PW漂洗液（70%～75%的乙醇漂洗溶液），重復以上離心操作。按照12 000轉/min的速度在室溫條件下進行離心處理，持續2 min后倒掉廢液。將吸附柱開蓋放置在室溫環境中，2～5 min后將吸附柱CR2轉入一個干凈的離心管中，將65℃預熱的30～100 μL洗脫緩沖液TE懸空滴加至吸附膜的中間部位，室溫放置2～5 min，按照12 000轉/min的速度在室溫條件下進行離心處理，持續2 min，將收集有DNA的離心管-20℃保存[10-13]。

將治療前后獲得的DNA樣本應用建立的基因文庫進行測序，分析各患者的基因突變情況。

1.3 觀察指標

對治療前的患者行NGS檢測并將檢測結果歸納總結后進行分析對比。使用化療與口服藥物治療1個月后，對患者進行CT（Computed tomography）等影像學檢查，此后每隔2個月進行1次復查。進行跟蹤隨訪時間結束后，對患者的腫瘤未進展或死亡時間進行最后一次評估。采用電話訪問、與主治醫師進行及時溝通、查閱復查病例的資料等對初始治療的患者進行隨訪，以確保研究數據的真實有效。記錄治療前以及治療后檢測出基因突變患者的數量以及具體的基因位點突變情況，分析基因突變特點;對比治療前以及治療后檢測出基因突變患者的基因位點平均突變個數，分析治療前后基因變化特點。

1.4 統計學分析

將數據錄入SPSS20.0軟件進行處理與分析，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料采用（n，%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因檢測結果

76例肺癌患者治療前NGS檢測結果提示58例患者存在基因突變，突變位點共計68個，突變基因主要以EGFR、KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene）和MET（Mesenchymal to epithelial transition factor）為主，EGFR基因突變共30個，KRAS基因突變共有20個，MET基因突變共有15個。見表1。治療后之前的58例基因位點突變患者僅18例患者存在基因位點突變，突變位點共計28個，基因突變主要以EGFR、KRAS和MET為主，EGFR基因突變共12個，KRAS基因突變共有8個，MET基因突變共有5個。見表2。

2.2 治療前以及治療后檢測出基因突變患者的基因位點平均突變個數比較

58例初治患者共發現68個基因位點突變，平均突變個數為1.17。治療后之前的58例基因位點突變患者僅18例患者存在基因位點突變，共發現28個基因位點突變，平均突變個數為1.56，可見治療后患者的基因突變數目增加，對此可以大膽進行假設患者的基因突變數目上升主要是因為治療過程中的不良反應所導致的。而根據數據分析能夠看出病情改善患者數量顯著增加，其差異有統計學意義（P<0.01，t=19.257）。見表3。

3討論

隨著科學技術的發展，NGS技術已經逐步滲透到癌癥病理分子診斷領域，其涉及的范圍也更為廣泛，在實體瘤以及血液惡性腫瘤的臨床診治中均有所涉及[14]。NGS技術利用具有平臺特異性的DNA文庫進行多重聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR），進而完成對目的基因擴增之后的測序。該技術適用于高通量測序，能夠對腫瘤中出現的基因組的突變進行檢測。NGS技術現已經實現在基因組、外顯子組、轉錄組以及表觀基因組等相關的基因研究組中的應用，為治療肺癌患者的診治機制以及醫療模式等帶來了改變[15]。這項新型技術的開展將改變現如今對于肺癌信號通路的認識，可為癌癥的臨床治療提供新的分子靶點[16]。NGS技術作為一種新的高通量測序，能夠實現較大規模的平行測序，包括對于多個樣品的靶向基因組區域進行同時測序，以實現對相同的運行檢測中伴隨的突變進行檢查[17]，能夠對多種基因組的異常同時進行高精度和高靈敏度的篩選，例如單/多核苷酸的突變、小基因與大基因的插入和缺失、拷貝數和融合物的轉錄等，能夠克服既往對于少見突變等傳統的認識，并且有望實現對等位基因突變進行評估。該技術因其具有可靠的優勢，目前在腫瘤領域，尤其是惡性腫瘤領域已實現廣泛應用。

本研究中的76例肺腺癌患者NGS基因檢測技術下，檢測到6種基因的不同突變形式，其中，包括點突變、插入缺失、基因融合以及擴增。本研究的患者在治療前后經過NGS檢測到的基因突變中，EGFR基因突變的陽性率均為最高數值，其次為KRAS和MET。以往研究結果顯示，無論是在總體基因突變個數或者是初次治療肺癌患者人群中，EGFR基因突變的陽性率占比均在50%左右，并且以點突變、插入缺失、基因融合以及擴增為主要的突變形式，大多數為EGFR 19/21外顯子突變，該結果與本研究結果較為相似。研究發現[9]，TP53（Tumor protein 53）基因突變與EGFR、ALK和KRAS共同存在會使其生存時間變短。但由于本次研究納入病例數量較小，尚未找到該作者所提出的這一基因與腫瘤演化的實際關聯性。近幾年來，腫瘤異質性逐漸引起了醫學界相關學者的關注，對于腫瘤的演變、轉移以及耐藥機制等均進行了深入研究[18]。

目前為止，以組織生物標志物為基礎進行診治仍是診斷肺癌患者的金標準，現階段接近32.5%的肺癌患者因體內沒有足夠的可用組織進行活檢，并且固體活檢并不能完全對于腫瘤的異質性進行顯示，導致其基因檢測受到限制。而“液體活組織檢查”的優勢在于不會造成侵入、能夠反復獲取以及經濟成本低等，逐漸成為NGS基因檢測過程中組織標本的替代物，成為近年來生物醫學研究的熱點。而本研究中對部分患者進行外周血采集或者制作胸水細胞蠟塊，并將其作為NGS基因檢測的樣本，結果顯示應用NGS基因檢測對組織樣本、血液樣本、胸水細胞蠟塊樣本進行基因測序，均明確檢測出其中EGFR、KRAS、MET、ALK、RET、PIK3CA等基因突變情況，說明應用NGS對組織標本或者液體標本進行基因檢測均可獲得準確的基因突變數據。Erin等[19]表示NGS能夠對血液或其他體液進行低豐度ctDNA的檢測，以NGS作為基礎的診斷方法，使用中性福爾馬林樣品活檢進行基因檢測的檢測方式已經被證實具有相對的高敏感性和特異性。該結論與本研究的結果相符。

劉東來等[20]研究提出隨著對腫瘤的持續治療，其腫瘤異質性明顯增加，其藥物耐藥性也有所增加，進一步說明腫瘤異質性是導致藥物耐藥性的關鍵原因。而本研究中58例存在基因突變的患者在治療后僅有18例存在基因突變，說明本研究所提出的治療方法能夠有效降低患者體內的腫瘤基因在耐藥方向的突變風險。但基因突變的平均突變數相比于治療前明顯提高，證實不同的個體化治療策略在一定程度上對患者的基因突變具有影響，另一方面，本研究所得到的治療方式的優化，能夠在臨床上對于患者的病癥情況進更為精準明確的分析，使無病灶患者能夠有效避免溢出治療所帶來的額外高昂治療費用以及不良反應。NGS的高效化、計算機化和生物信息化技術在推動科技進步的同時，患者知情權和數據發布的相關倫理問題也逐漸體現出來。該技術仍有部分局限性，如需要的時間、實驗設備不便捷以及計算機數據分析等各方面需要大量的投入。

NGS基因檢測技術在肺癌基因檢測中具有獨特的優勢，可應用于單細胞和游離的ctDNA，同時可對從組織樣本、胸水細胞蠟塊、血液樣本等多個樣本類型中獲取的DNA樣本進行準確的基因測序與檢測，具有極高的靈敏度與特異性，能夠推動腫瘤基因突變的基礎和臨床研究，降低檢測的經濟成本，使其能夠實現在肺癌患者的臨床診斷和治療中的推廣應用。

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（收稿日期：2020-05-20）