玄黃藥膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

程 延，趙朝偉，李 浩，楊謝安，魏 兵，王彥鵬，全 健，竇群立，昝 強(qiáng)

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.洛南縣中醫(yī)醫(yī)院，陜西 洛南 726100；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712021)

急性軟組織損傷是骨科常見病、多發(fā)病，中醫(yī)屬“筋傷”范疇，可單獨(dú)出現(xiàn)，也可同時(shí)伴有骨折，損傷后的腫痛和肢體活動(dòng)受限，給患者造成很大痛苦，甚至導(dǎo)致不同程度的殘疾而嚴(yán)重影響患者身體健康和生活質(zhì)量，對(duì)其治療的研究日益受到重視。在暴力作用下，機(jī)體皮膚、肌肉、肌腱、筋膜、韌帶等軟組織受到撞擊、扭轉(zhuǎn)、牽拉等作用后，隨即出現(xiàn)急性無(wú)菌性炎癥改變，伴隨免疫功能降低或紊亂。資料表明，中醫(yī)藥對(duì)于損傷的軟組織有較好的治療作用和免疫調(diào)節(jié)作用。中藥具有資源豐富、用藥成本低、藥力持久、低或無(wú)副反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，研制具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥制劑是新藥開發(fā)的重要內(nèi)容[1]。玄黃藥膏是我院用于治療“氣滯血瘀型”急性筋傷(急性軟組織損傷)的經(jīng)驗(yàn)方，臨床實(shí)踐證明，該藥療效顯著，安全、未出現(xiàn)毒副作用及過(guò)敏反應(yīng)，取得較好的臨床效果[2-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明[5-6]，玄黃藥膏可以降低損傷局部組織中如白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)等多種炎癥因子含量而發(fā)揮較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討玄黃藥膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠90只，雌雄各半，體重237～401 g，平均313.33 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物資格證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。實(shí)驗(yàn)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，動(dòng)物室室溫19～24 ℃，相對(duì)濕度約40%。實(shí)驗(yàn)前選用標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由清潔飲水，每?jī)商烨鍧嵒\具1次。

1.1.2 主要試劑和儀器：玄黃藥膏：由酒大黃15 g，梔子30 g，蒲公英9 g，乳香、沒藥各8 g，蟲3 g組成。購(gòu)自陜西省中醫(yī)醫(yī)院中藥房，藥監(jiān)合格，藥物按比例粉碎，用100目篩子篩為細(xì)末備用。樣品藥制備：用凡士林為基質(zhì)與藥粉以質(zhì)量比為1∶1的比例制成所需藥膏。扶他林軟膏(北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990291)。無(wú)水乙醇、中性樹膠、7%硫化鈉溶液、10%水合氯醛溶液等由西安恩斯維爾生物公司提供，姬姆薩復(fù)合染液、蘇木精染液、液體石蠟、伊紅染液、甲醛溶液等由北京索萊寶公司提供。燒杯、采血管、刻度試管、高精度加樣器、離心管、移液槍、包埋盒、切片刀頭、一次性吸管等由西安恩斯維爾生物公司提供，分光光度計(jì)、天平、水浴鍋、恒溫箱、包埋機(jī)、切片機(jī)、高速冷凍離心機(jī)等由陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，局部打擊器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模、分組與給藥：將動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組三組，每組30只。術(shù)前脫毛處理：實(shí)驗(yàn)前1天用8%硫化鈉涂抹于大鼠左側(cè)大腿中部。造模方法[7]：將大鼠麻醉后，選擇左側(cè)后肢大腿中部外側(cè)肌肉豐隆處，使用100 g砝碼、從垂直高度50 cm處，自由落體落下，準(zhǔn)確打擊，反復(fù)進(jìn)行3次，造成皮下瘀斑、腫脹的閉合性軟組織損傷模型，且無(wú)骨折和開發(fā)性破損。造模成功30 min后開始給藥，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組分別予玄黃藥膏和扶他林、凡士林各3 g外敷，醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，膠布固定。每24 h換藥1次。連續(xù)治療7 d后測(cè)量各指標(biāo)。

1.2.2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率檢測(cè)：取大鼠尾部靜脈血1滴，置于玻片的一端，另取邊緣光滑平整的玻片作推片，使血滴成片狀，推成血膜(頭、體、尾分明)干燥，等其干燥后用姬薩姆染液染色3～7 min，再用生理鹽水沖洗，濾紙干燥后使用油鏡觀察。計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：觀察每張玻片的頭、體、尾三段。每段各一縱列(目的是減少誤差)，每張玻片計(jì)數(shù)200～400個(gè)細(xì)胞，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，其中頭部50～100個(gè)，體部50～100個(gè)，尾部100～200個(gè)。一般認(rèn)為轉(zhuǎn)化率的正常值為60%～70%。計(jì)算公式：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞/(轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞+未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞)×100%。

1.2.3 巨噬細(xì)胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)：治療第4 天(即正式采集標(biāo)本前72 h)將5%可溶性淀粉酶注射入各組大鼠腹腔中作為誘導(dǎo)劑使大鼠產(chǎn)生腹腔巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前1 h向大鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液(具有清晰細(xì)胞核)0.6 ml，全部注射后輕柔大鼠腹部2 min。水合氯醛鎮(zhèn)定麻醉下在大鼠腹部中央使用剪子剪開皮膚一小口，暴露腹膜，是用鑷子提起腹膜剪一小口，使用無(wú)菌吸管吸取腹腔液，滴入玻片中，使用另一張潔凈玻片推片，置入37 ℃溫箱中孵育30 min。取出涂片，生理鹽水輕輕沖洗表面，待自然干燥后使用姬姆薩懷特(Giemsa-Wright)染液染色，3 min后再用生理鹽水輕輕沖洗，濾紙濾干水分，使用丙酮-甲醇溶液進(jìn)行固定，并蓋上蓋玻片。放入油鏡下觀察200個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算吞噬百分率及吞噬指數(shù)[8]。計(jì)算公式：吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞×100%，吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 補(bǔ)體活性檢測(cè)：每組大鼠心臟取血、靜置。第1步：制備50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管，取2%綿羊紅細(xì)胞懸液2 ml加入蒸餾水8 ml，待細(xì)胞完全溶解后為100%全溶血管。取全溶血管上清液2.5 ml并加入巴比妥緩沖液2.5 ml，1∶1混勻后，即為50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管。第2步：制備大鼠血清，將大鼠水合氯醛鎮(zhèn)定麻醉后，心臟取血，將血液分別放入無(wú)菌試管中4 ℃冰箱靜置保存，待血液分層后用無(wú)菌吸管將大鼠血清吸出放入無(wú)菌錐瓶混勻，再使用無(wú)菌刻度吸管每次吸入1 ml血清放入小離心管內(nèi)蓋好并-60 ℃保存。第3步：測(cè)算血清補(bǔ)體活性，實(shí)驗(yàn)前取1只大鼠血清于室內(nèi)融化，后取大鼠血清0.2 ml與巴比妥緩沖液3.8 ml進(jìn)行1∶20稀釋，取10支試管，順序編號(hào)后按表1所示將各試劑加入、混勻，其中抗綿羊紅細(xì)胞溶血素按效價(jià)稀釋至1∶2000，置于37 ℃水浴箱中30 min后拿出，將各反應(yīng)管以2500 r/min離心5 min，先目測(cè)觀察各管并與50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管比較，選擇溶血度與標(biāo)準(zhǔn)管最接近的兩管，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)542 nm處進(jìn)行比色。巴比妥緩沖液為空白矯正零點(diǎn)，按透光率百分比比測(cè)找出最接近標(biāo)準(zhǔn)管的一管，根據(jù)該管血清使用量，測(cè)算補(bǔ)體活性[9]。計(jì)算公式：補(bǔ)體活性(U/ml)=1/血清用量(ml)×血清稀釋倍數(shù)。

1.2.5 脾重及脾指數(shù)：大鼠稱量體重后，處死開腹，摘除脾臟，濾紙吸干殘留血液及腹腔液，分析天平稱重。計(jì)算公式如下：脾指數(shù)[10]=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.2.6 組織病理學(xué)觀察：取各組大鼠肌纖維，行HE染色，鏡下觀察各組大鼠肌細(xì)胞情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、吞噬百分率和吞噬指數(shù)比較 治療7 d后，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、吞噬百分率和吞噬指數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、吞噬百分率和吞噬指數(shù)比較

2.2 各組大鼠補(bǔ)體活性、脾重和脾指數(shù)比較 治療7 d后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠補(bǔ)體活性以及脾重、脾指數(shù)與空白組相比均增強(qiáng)或升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠補(bǔ)體活性、脾重和脾指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠補(bǔ)體活性、脾重和脾指數(shù)比較

2.3 各組肌纖維組織病理學(xué)改變 空白組肌纖維排列規(guī)則，分界清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，染色均勻，未見明顯異常；對(duì)照組肌纖維排列規(guī)則，分界清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，染色均勻，局部出血，間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組肌纖維排列規(guī)則，分界清晰，間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見出血(圖1)。

圖1 三組大鼠肌纖維組織病理圖片(HE染色，×200)

3 討 論

機(jī)體受到外傷時(shí)免疫系統(tǒng)迅速作出反應(yīng)，隨后發(fā)生一過(guò)性的改變，這種改變可歸類為“促炎”和“抑制炎癥”反應(yīng)。正常機(jī)體有一種精細(xì)的調(diào)節(jié)功能，將免疫應(yīng)答控制在適當(dāng)范圍內(nèi)。一旦這種調(diào)節(jié)作用受損或喪失，會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。人為的進(jìn)行干預(yù)，使機(jī)體避免產(chǎn)生異常的免疫應(yīng)答，或使已出現(xiàn)的異常免疫應(yīng)答得以逆轉(zhuǎn)，是現(xiàn)代多種疾病免疫治療形成和發(fā)展的基礎(chǔ)[11]。目前，西藥免疫治療藥物如補(bǔ)體活性抑制劑依庫(kù)麗單抗等廣泛應(yīng)用于臨床，雖有療效，但治療局限，毒副作用大[12]。中藥及方劑大多屬天然動(dòng)植物，藥理應(yīng)用體系多樣，且耐藥性低、不良反應(yīng)少。因此，探尋更加安全、有效的具有免疫治療作用的中藥有著重要的意義。我國(guó)學(xué)者為此做了大量研究。曹錦花[13]研究發(fā)現(xiàn)，茵陳、黃芩等組成的方劑具有清熱解毒、利膽退黃、調(diào)節(jié)免疫作用。繆頻等[14]應(yīng)用中藥方(由茵陳、青蒿、黃芩等組成)治療新生兒ABO血型產(chǎn)前溶血，提示該方可降低血清膽紅素水平，提高免疫功能，有效率達(dá)95.00%。田昕[1]研究發(fā)現(xiàn)，外用乙乙膏(桑寄生、雞血藤、大黃等)可調(diào)節(jié)急性軟組織損傷大鼠體液免疫和細(xì)胞免疫狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)免疫器官的保護(hù)和恢復(fù)作用。研究表明，杜仲、木香、金銀花具有良好的抗補(bǔ)體活性作用，研究和發(fā)掘抗補(bǔ)體活性的中藥必將為臨床提供多樣化的治療方式[15]。本方中大黃、蟲有破瘀通經(jīng)、消腫止痛的作用，乳香、沒藥活血行氣，梔子、蒲公英清熱舒筋，共同協(xié)助大黃化瘀泄熱。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其對(duì)損傷機(jī)體免疫功能的影響。

機(jī)體受抗原刺激后，淋巴細(xì)胞發(fā)生變化，向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，釋放淋巴因子等一系列免疫物質(zhì)，促進(jìn)損傷修復(fù)。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞，參與天然免疫，并在獲得性免疫應(yīng)答中起協(xié)同作用，具有分泌多種細(xì)胞因子，捕捉、吞噬、溶解病原體，參與抗原遞呈等作用[11]。機(jī)體的非特異性免疫功能一定程度上由巨噬細(xì)胞吞噬活性大小反應(yīng)完成[16]。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、巨噬細(xì)胞吞噬率變化可反映細(xì)胞免疫的狀態(tài)和機(jī)體損傷的恢復(fù)能力[1]。本實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)玄黃藥膏和扶他林治療的大鼠，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)和淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率均有不同程度的增加，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明本方能夠提高大鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，對(duì)體內(nèi)的免疫功能有促進(jìn)作用。

補(bǔ)體是具有酶活性的蛋白質(zhì)，存在于人和脊椎動(dòng)物血清和組織液中，其正常活化有利于增強(qiáng)免疫力，但過(guò)度激活可引起組織損傷等[17-19]。補(bǔ)體能使溶血素(抗綿羊紅細(xì)胞抗體)致敏的綿羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血，綿羊紅細(xì)胞濃度恒定時(shí)補(bǔ)體活性與溶血程度呈正比。因此，可通過(guò)溶血程度來(lái)判斷血清中的補(bǔ)體含量，反映其對(duì)機(jī)體體液免疫功能的影響[1]。免疫器官(如胸腺、脾臟)重量變化在一定程度上反映了機(jī)體的免疫功能。李覃等[20]研究表明，中藥青蒿素能明顯降低遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型小鼠免疫器官的臟器(胸腺、脾)指數(shù)，顯示出一定的免疫抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，玄黃藥膏與空白組相比大鼠補(bǔ)體活性增強(qiáng)，脾重和脾指數(shù)升高，提示玄黃藥膏有利于促進(jìn)大鼠體液免疫功能，對(duì)免疫器官功能有保護(hù)作用，與上述研究結(jié)論一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玄黃藥膏可使急性軟組織損傷大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和補(bǔ)體活性增強(qiáng)、脾重量和脾指數(shù)增加，提示玄黃藥膏治療急性軟組織損傷可能與抗炎作用和增強(qiáng)機(jī)體的免疫力有關(guān)。但值得提出的是，因?yàn)檎€(gè)體免疫系統(tǒng)有一定的代償能力，免疫應(yīng)答機(jī)制會(huì)得到恢復(fù)乃至增強(qiáng)以提高自身的抗病能力，恢復(fù)速度及程度取決于創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間，而且，重度創(chuàng)傷(如嚴(yán)重軟組織傷)對(duì)免疫功能有明顯的抑制作用，輕度創(chuàng)傷則有增強(qiáng)作用[21-23]。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立在相對(duì)“輕的軟組織損傷”基礎(chǔ)上，治療中未出現(xiàn)因免疫反應(yīng)增強(qiáng)而發(fā)生的組織損傷，說(shuō)明玄黃藥膏協(xié)同增強(qiáng)免疫功能而發(fā)揮了積極作用。所以，本實(shí)驗(yàn)未能回答玄黃藥膏對(duì)促進(jìn)免疫功能是否最優(yōu)化及最優(yōu)化的使用量、是否對(duì)嚴(yán)重的軟組織傷的免疫抑制有效等問題，值得進(jìn)一步研究。