MicroRNA-335-5p對類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞的影響*

姜煒，沈曄，龍小琴

（湖州市第三人民醫院1.檢驗科，2.風濕免疫科，浙江 湖州313000）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種常見的炎癥性疾病，影響全球超過1%的人口，主要表現為炎癥、滑膜炎、關節軟骨及骨損傷，若不及時治療，40%～70%患者最終會發展為殘疾[1-2]。病程較長的患者除累及關節外，還可并發肺間質性疾病、心血管疾病等[3-4]，這將大大增加患者的疾病負擔和社會負擔，因此應盡早診斷和充分治療[5]。近年來，microRNAs（miRNAs）在RA 發病機制中發揮重要作用的報道越來越多[6-7]。miRNA 與靶向mRNA的3'-非編碼區（3'-untranslated region, 3'-UTR）結合，通過負調控基因表達，導致mRNA 降解或相應蛋白下調。XU 等[6]報道miR-650 可以通過靶向Akt2，抑制類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs）的增殖、遷移和侵襲。最近一項研究結果表明，miR-126 通過PI3K-Akt 信號通路，影響RASFs 增殖和凋亡[7]。DKK1 是一種Wnt 信號通路抑制劑，被認為是關節重塑的主要調節因子[8]。據報道，RA 患者病情嚴重程度與血清DKK1水平呈正相關[9]。RA 患者血清DKK1 水平較高，進一步破壞關節，提示DKK1 在RA 發病機制中具有重要作用[10]。本研究通過分析miR-335-5p 在RA 發病機制中的作用，探討其與DKK1 的作用機制，為RA 的治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2018年3月—2019年3月在湖州市第三人民醫院實施關節手術的50 例RA 患者的滑膜組織標本（RA組）。其中，男性32例，女性18例；年齡35～68歲，平均（50.3±7.5）歲。所有患者符合美國風濕病學會疾病分類標準[11]。選取同期本院行關節置換手術的關節外傷患者50 例，取其滑膜組織標本（對照組）。其中，男性26例，女性24例；年齡33～65歲，平均（48.5±6.4）歲。排除標準：嚴重高血壓、糖尿病等基礎疾病；傳染病和癌癥；嚴重心、肝、腎損傷等系統性疾病；合并感染、免疫類疾病。本研究經醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》的指導方針和原則。所有參與者簽署書面知情同意書。

1.2 細胞系和細胞培養

采集的滑膜組織在37℃條件下，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化2 h。將消化后的滑膜組織離心得到RASFs。RASFs 置于改良后的DMEM 培養基中，輔以10%胎牛血清、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度的培養箱中培養。轉染前24 h，將融合度為75%的細胞接種于6 孔板中培養。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑改良后的DMEM 培養基、Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑盒和Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司），10% 胎牛血清（美國Thermo Fisher Scientific公司）， Cell Proliferation ELISA, BrdU 試劑盒（美國Roche Applied Science），microRNA 檢測試劑盒（美國Applied Biosystems 公司），Annexin V-FITC/PI 試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司），基質凝膠（美國BD Biosciences 公司），RIPA 裂解緩沖液和BCA 蛋白分析試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所），蛋白酶抑制劑（上海羅氏制藥有限公司），熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega 公司），miR-335-5p模擬物（miR-335-5p）、miR-335-5p 陰性對照（miR-NC）、DKK1 siRNA （si-DKK1，5'-TGATAGCCCTGTACAATGCTGCT-3'）、siRNA陰性對照（si-NC）、miR-335-5p 模擬物和pcDNA 載體（miR-335-5p+pcDNA）、 miR-335-5p 模 擬 物 和pcDNA-DKK1（miR-335-5p+pcDNA-DKK1）均購自上海基因制藥有限公司。

1.3.2 主要儀器RNA 逆轉錄系統（美國Thermo Fisher Scientific 公司），ABI PRISM 7500 序列檢測系統（美國ABI 公司），流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司），Fusion FX5 圖像分析系統（法國Vilber 公司）。

1.4 方法

1.4.1 細胞轉染將DKK1 cDNA 插入pcDNA3.1 載體生成DKK1 過表達質粒。 參照Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑盒說明書進行操作，根據細胞轉染情況將細胞分為miR-335-5p 組（將miR-335-5p模擬物轉染到RASFs 細胞系中）、miR-NC 組（將miR-335-5p 陰性對照轉染到RASFs 細胞系中）、si-DKK1 組（將DKK1 siRNA 轉染到RASFs 細胞系中）、si-NC 組（將siRNA 陰性對照轉染到RASFs 細胞系中）、miR-335-5p+pcDNA組（將miR-335-5p模擬物和pcDNA 載體轉染到RASFs 細胞系中）、miR-335-5p+pcDNA-DKK1組（將miR-335-5p和DKK1過表達質粒轉染到RASFs 細胞系中）。具體步驟如下：①轉染前1 天，將RASFs 細胞按1×106個/孔的密度接種于6 孔板；②轉染當天將Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑與opti-MEM 培養液及合成的miR-335-5p 模擬物、miR-NC 或si-DKK1 均勻混合，室溫孵育5～10 min 后加入細胞培養液中；③轉染48 h 后，胰酶消化細胞，PBS沖洗1次，保存備用。

1.4.2 ELISA 比色法采用ELISA 比色法檢測miR-335-5p 模擬物和si-DKK1 對RASFs 細胞增殖的影響。按照Cell Proliferation ELISA, BrdU 試劑盒說明書進行操作，檢測細胞增殖情況。將RASFs 細胞按5×103個/孔的密度接種于96 孔板，在完全培養基中生長過夜。去除培養基，在37℃條件下用miR-335-5p 模擬物或si-DKK1 轉染細胞48 h，再用BrdU 標記液處理16 h。隨后去除培養基，固定細胞，變性。細胞在抗BrdU-POD 溶液中孵育90 min，洗滌3 次去除抗體偶聯物。TMB 底物孵育15 min 后，在405 nm 和490 nm 的吸光度下測定免疫復合物的OD 值。

1.4.3 RNA 提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）參照Trizol 試劑盒說明書進行操作，從細胞系和臨床樣本中提取總RNA。采用260 nm 和280 nm的紫外吸收光譜（A260/280）檢測RNA。使用逆轉錄系統將RNA 逆向轉錄為cDNA。采用ABI PRISM 7500 序列檢測系統和microRNA 檢測試劑盒檢測miR-335-5p 水平。擴增體系：2 μl cDNA、0.4 μl 正向引物、0.4 μl反向引物、7.2 μl H2O2和10 μl SYBR。擴增條件：25℃、10 min，48℃、30 min，95℃、5 min，U6 作為實驗內參。采用SYBR?Green熒光染色檢測DKK1 mRNA 相對表達量，GAPDH 作為實驗內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.4 流式細胞術使用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測細胞凋亡情況。將RASFs 細胞按1×105個/孔的密度接種于6 孔板中，PBS 洗滌2 次，重懸于緩沖液中。取5×105～10×105個重懸的細胞，200 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。采用流式細胞儀進行測量，以區分凋亡細胞（Annexin V 陽性和PI 陰性）和壞死細胞（Annexin V 陽性和PI 陽性）。

1.4.5 Transwell 法采用預先涂有包含細胞外基質蛋白的基質凝膠Transwell 室（孔徑8 mm）進行Transwell 基質凝膠侵襲實驗，以確定細胞的侵襲性。常規胰蛋白酶消化細胞，調整細胞濃度為5×105個/ml。取200 μl 細胞懸液加入Transwell 上室，并將600 μl含10% 胎牛血清的DMEM 培養基加入下室。在37℃、5%CO2環境下孵育6 h。取出小室，PBS 洗滌2 次，用棉簽將上室細胞擦去，將穿透的細胞固定在甲醇中，0.1%結晶紫染色，30%冰醋酸漂洗細胞膜，最后在540 nm 處檢測洗滌液，計算細胞數量。所有實驗重復3次。

1.4.6 Western blotting將RASFs 細胞用冷的PBS洗滌2 次，然后用RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白。采用BCA 蛋白分析試劑盒對蛋白進行定量分析。取50 μg 總蛋白上樣，經10%SDS-PAGE 分離并轉移到PVDF 膜上，在37℃條件下用5% 脫脂乳封閉1 h，加入一抗DKK1 （1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4℃條件下孵育過夜，TBS 洗滌PVDF 膜3 次，10 min/次。加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBS 洗滌3 次，10 min/次。采用Fusion FX5 圖像系統進行分析。

1.4.7 熒光素酶報告基因檢測將RASFs 細胞接種于24 孔板中，轉染前孵育24 h，待細胞融合達60%時，將miR-335-5p 模擬物和miR-NC 分別與DDK1 3'-UTR 野生型或突變型重組質粒共轉染。轉染48 h 后，參照熒光素酶檢測試劑盒說明書進行操作，采用Renillaluciferase 報告基因檢測熒光素酶活性。所有實驗重復3 次。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 7.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DKK1 mRNA 在滑膜組織和RASFs 中的表達

qRT-PCR 反應結果顯示，RA 組、對照組患者滑膜組織中DKK1 mRNA 相對表達量分別為（4.82±0.30）和（1.21±0.11），經t檢驗，差異有統計學意義（t=61.881，P=0.000），RA 組高于對照組。此外，在RASFs 細胞系中，RA 組、對照組患者DKK1 mRNA 相對表達量分別為（6.51±0.42）和（1.50±0.13），經t檢驗，差異有統計學意義（t=62.414，P=0.000），RA 組高于對照組。

2.2 敲除DKK1 對RASFs 細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

qRT-PCR 和Western blotting 檢測結果表明，si-DKK1 組、si-NC 組DKK1 mRNA 相對表達量分別為（0.37±0.03）和（1.12±0.15），經t檢驗，差異有統計學意義（t=25.263，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。si-DKK1 組、si-NC 組DKK1 蛋白相對表達量分別為（0.41±0.04）和（1.01±0.10），經t檢驗，差異有統計學意義（t=40.281，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。

ELISA 比色法結果顯示，si-DKK1 組、si-NC 組RASFs 細胞增殖能力（OD 值）分別為（0.51±0.05）和（1.55±0.16），經t檢驗，差異有統計學意義（t=20.873，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。體外侵襲實驗結果表明，si-DKK1 組、si-NC 組RASFs 細胞侵襲能力（OD值）分別為（1.01±0.12）和（2.52±0.22），經t檢驗，差異有統計學意義（t=16.474，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。

si-DKK1 組與si-NC 組RASFs 細胞促凋亡蛋白（Bax、FAS、BIM、Cleaved Caspase-3）和細胞凋亡率比較，經t檢驗，差異有統計學意（P＜0.05），si-DKK1 組高于si-NC 組。見表2和圖1、2。

表2 兩組RASFs促凋亡蛋白和細胞凋亡率比較 （±s）

表2 兩組RASFs促凋亡蛋白和細胞凋亡率比較 （±s）

組別Bax FAS DKK1組NC組值1.12±0.11 0.34±0.03 15.297 1.03±0.10 0.36±0.04 13.910 BIM Cleaved Caspase-3細胞凋亡率/%sisit P 值0.0000.000 1.15±0.20 0.41±0.04 8.113 0.000 1.11±0.13 0.32±0.03 13.240 0.000 30.24±0.31 10.25±0.16 128.130 0.000?

圖1 促凋亡蛋白在RASFs中的表達

2.3 DKK1是miR-335-5p的直接作用靶基因

qRT-PCR 反應結果顯示，RA 組、對照組患者滑膜組織中miR-335-5p 相對表達量分別為（0.50±0.05）和（1.00±0.10），經t檢驗，差異有統計學意義（t=27.970，P=0.000），RA 組低于對照組。RA組、對照組患者RASFs 中miR-335-5p 相對表達量分別為（0.25±0.03）和（1.01±0.11），經t檢驗，差異有統計學意義（t=40.281，P=0.000），RA 組低于對照組。

生物信息學預測顯示，DKK1基因的3'-UTR 包含了一個miR-335-5p 靶序列（見圖3）。在RASFs細胞系中，miR-335-5p 組與miR-NC 組熒光素酶活性比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p 組低于miR-NC 組（見表3）。

qRT-PCR 和Western blotting 檢測結果表明，miR-335-5p組與miR-NC 組DKK1 mRNA 和蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p組低于miR-NC組。見表3和圖4。

圖2 敲除DKK1對RASFs凋亡的影響

圖3 3'-UTR的miR-335-5p靶序列

表3 兩組RASFs熒光素酶活性和DKK1相對表達量比較 （±s）

表3 兩組RASFs熒光素酶活性和DKK1相對表達量比較 （±s）

組別熒光素酶活性DKK1 mRNA DKK1蛋白miR-335-5p組miR-NC組t 值P 值0.41±0.05 0.94±0.10 25.965 0.000 0.42±0.05 1.02±0.11 27.198 0.000 0.51±0.05 1.12±0.13 23.988 0.000

圖4 兩組RASFs的DKK1表達

2.4 過表達miR-335-5p 對RASFs 增殖、侵襲和凋亡的影響

在RASFs 中，miR-335-5p 組與miR-NC 組miR-335-5p 相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p 組高于miR-NC 組。ELISA 比色法結果顯示，miR-335-5p 組與miR-NC組RASFs 增殖能力比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p組低于miR-NC 組。Transwell 法結果表明，miR-335-5p 組 與miR-NC 組RASFs 細胞侵襲能力比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p 組低于miR-NC 組。miR-335-5p 組與miR-NC 組RASFs 凋亡率比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p組高于miR-NC 組。見表4和圖5。

表4 兩組RASFs細胞miR-335-5p及細胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

表4 兩組RASFs細胞miR-335-5p及細胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

組別增殖能力侵襲能力miR-335-5p細胞凋亡率/%miR-335-5p組miR-NC組t 值P 值12.15±1.15 1.00±0.10 62.675 0.000 0.53±0.04 1.80±0.20 34.105 0.000 1.01±0.10 2.52±0.12 27.198 0.000 31.02±2.15 10.11±1.12 23.988 0.000

圖5 過表達miR-335-5p對RASFs凋亡的影響

2.5 上調DKK1 減弱miR-335-5p 過表達對RASFs的影響

為證實miR-335-5p 是否通過直接下調DKK1 影響RASFs，將miR-335-5p 模擬物和pcDNA-DKK1共轉染RASFs。miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNA-DKK1 組DKK1 mRNA 和蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p+pcDNA 組較低（見表5和圖6）。ELISA比色法結果顯示，miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNA-DKK1 組RASFs 增殖能力比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p+pcDNA 組增殖能力較低。Transwell 法結果表明，miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNADKK1 組RASFs 細胞侵襲能力比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）， miR-335-5p+pcDNA 組侵襲能力較低。miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNA-DKK1 組細胞凋亡率比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-335-5p+pcDNA 組細胞凋亡率較高（見表5和圖7）。

表5 兩組RASFs的DKK1及細胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

表5 兩組RASFs的DKK1及細胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

組別DKK1 mRNA DKK1蛋白增殖能力侵襲能力細胞凋亡率/%miR-335-5p+pcDNA組miR-335-5p+pcDNA-DKK1組t 值P 值1.00±0.11 2.25±0.24 25.933 0.000 0.51±0.05 1.12±0.13 23.988 0.000 0.70±0.08 1.80±0.10 47.047 0.000 0.91±0.09 2.11±0.10 48.854 0.000 30.12±3.05 10.03±1.14 33.794 0.000

圖6 兩組RASFs中的DKK1表達

圖7 上調DKK1減弱miR-335-5p過表達對RASFs的影響

3 討論

RA 是一種病因不明的自身免疫性疾病，其特征在于慢性炎癥和免疫細胞的滑膜浸潤，目前對其發病機制尚未完全了解。RA 的初始階段與先天性和適應性免疫系統改變相關，從而產生針對各種分子的自身抗體。RA 發病機制中涉及的關鍵細胞、介質及機制的研究可以為開發新的、精準治療疾病的抗風濕藥提供依據[12]。既往研究報道，DKK1 通過促進RANKL 誘導破骨細胞形成，直接影響成骨細胞分化，間接促進骨破壞[8]。在RA 模型中，DKK1 在RASFs 體外表達，受到糖皮質激素代謝的嚴格調控，并支持Wnt 信號抑制其在RA 骨破壞中的作用[13]。JUAREZ 等[14]研究發現，在RA 早期檢測到DKK1 差異表達，提示DKK1 表達增加可能是RA 進展的關鍵事件，并發生在疾病早期。DKK1抑制Wnt 信號可能是早期RA 患者RASFs 影響骨破壞的一個途徑。本研究發現，DKK1 在RA 組織和細胞中的表達明顯升高。沉默DKK1 可以抑制RASFs 的增殖和侵襲，并促進RASFs 的凋亡。可見，DKK1 在RA 發病機制中扮演重要作用。

研究表明，miRNAs 在多個生物過程中發揮多功能作用，如細胞增殖、分化、凋亡、遷移、炎癥，以及異常先天免疫反應期間的侵襲，使其成為治療眾多自身免疫性疾病的潛在靶點[15-16]。越來越多的證據表明，miRNAs 與RA 的發生、發展關系密切[17]。既往報道表明，RA 患者RASFs 中miR-522、miR-338-5p、miR-29a 等的相對表達量發生改變，提示其在RA 發病機制中起到RA 激動劑或抑制因子的作用[18-20]。TSENG 等[21]采用下一代測序技術分析RASFs 中轉錄組與miRNA 的差異表達譜，鑒定出眾多miRNA 異常表達，其中miR-335-5p 相對表達量顯著降低。因此，miRNA 表達的改變可作為RA 治療的潛在標志物。本研究同樣發現，RASFs 中miR-335-5p 相對表達量降低，提示miR-335-5p 可能與RA 的發病機制有關。

通常miRNAs 通過作用不同的靶點介導多個生物學過程，調控其下游mRNA 靶基因的表達[22-23]。多項研究表明，miR-335-5p 可靶向多種mRNA，如miR-335-5p 通過靶向ICAM-1 抑制甲狀腺癌細胞的侵襲和轉移[24]；miR-335-5p 通過靶向BCL2L2 提高順鉑對卵巢癌細胞的敏感性[25]；miR-335-5p 通過下調LDHB 抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[26]；miR-335-5p 通過靶向c-jun-N末端激酶3 抑制β-淀粉樣蛋白積累，減輕認知障礙[27]；膿毒癥小鼠模型中，miR-335-5p 通過靶向和抑制FASN 并激活AMPK/ULK1 信號通路從而減輕炎癥反應[28]。本研究通過生物信息學預測顯示，DKK1 3′UTR 包含了一個miR-335-5p 靶序列。在RASFs 中，熒光素酶報告基因檢測進一步證實DKK1 是miR-335-5p的直接靶點。與對照組相比，轉染miR-335-5p 模擬物的RASFs 中DKK1 mRNA 和蛋白相對表達量降低。過表達miR-335-5p 可以顯著抑制RASFs 的增殖和侵襲，并促進RASFs 的凋亡。此外，過表達DKK1 顯著逆轉了miR-335-5p 對RASFs 的作用。可見，miR-335-5p 通過促進RASFs 凋亡，在RA 中發揮保護作用，延緩疾病進展。

綜上所述，本研究探討miR-335-5p 及其靶基因DKK1對RASFs 的影響，并闡明了RA 可能的病理機制。雖然miR-335-5p 和DKK1 有望成為RA 的有效治療靶點，但是其完整的作用機制仍需進一步研究。