海帶多酚提取工藝優化及抗氧化性研究*

汪群，雷思佳，付慧娟，林珊，鄭康燕，賴雯娟，周如意

（深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

海帶（Laminaria japonica）是一種大型食用海藻，屬于褐藻門（Phaeophyta）、褐藻綱（Phaeophyceae）、海帶目（Laminariales）、海帶科（Laminariaceae）、海帶屬（Laminaria）．海帶富含蛋白質、脂肪、糖類、碘、維生素以及多種微量元素，因此具有較高的營養價值．海帶多酚是一類具有多酚羥基的化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、生物防御等多種生物活性[1-3]．目前多酚有多種提取方法，如溶劑提取法、超聲波輔提法、微波輔提法、超臨界流體萃取法等．其中超聲波輔助提取法是在溶劑萃取的基礎上輔以超聲波震動，是一種高效的技術方法[4]．多酚的抗氧化活性很強，被認為是天然的抗氧化劑或自由基清除劑[5]．Cofrades等[6]研究結果表明，褐藻和紅藻多酚均具有不同程度的抗氧化活性．趙國玲等[7]研究證明多酚類化合物是壇紫菜中主要的抗氧化活性成分．根據多酚在食品基質中的存在形態，可分為游離多酚和結合多酚．游離多酚主要是以單體形式存在的多酚，而結合多酚主要是由共價鍵與其他大分子物質（蛋白質、纖維素、半纖維素、果膠等）結合的酚類物質[8]．目前的研究主要集中于游離多酚，而較少研究結合多酚．然而，多酚的抗氧化活性與結合多酚的含量及組成密切相關[9,10]．相對于游離多酚，結合多酚不能被胃和小腸消化吸收，但經腸道菌群發酵后可能具有更強的生物活性[11,12]．在結腸中，結合多酚在腸道微生物及酶的作用下可被降解為苷元或簡單酚類物質，進而被人體吸收發揮其生物活性，或通過促進有益菌生長以及抑制腸道致病菌增殖調節腸道微生態的平衡，有益于機體健康[13-15]．因此，有必要重點從結合多酚及游離多酚的角度，全面評價海帶多酚的構成及其抗氧化活性，為深度發掘海帶潛在的營養價值和生物活性提供依據．

我國海岸線長，海帶養殖面積大、產量高、資源豐富，且具有較高的功能活性．近年來，人們對海帶營養保健價值的認識越來越高，對其研究已成為熱點．多酚是海帶生理活性的重要物質基礎，然而目前主要是對海帶多酚進行綜合研究，鮮少對海帶游離多酚和結合多酚的提取工藝和抗氧化性分別進行探究．本研究采用正交試驗對海帶游離多酚和結合多酚的提取工藝進行優化，再通過測定 DPPH自由基清除能力研究其抗氧化性，以期為深入研究海帶的功能活性提供參考依據，同時也為高效、低副作用的天然抗氧化劑的開發提供思路，進一步提高海帶資源綜合利用水平．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海帶產自山東威海，將樣品凍干、粉粹，并過250 μm篩得到干粉，密封備用．

1.2 儀器與試劑

RV10型旋轉蒸發儀，德國 IKA公司；KQ-300VDE型雙頻數控超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；Spectra Max?M5型酶標儀，美國Molecular Devices公司；DKZ-3B型水浴恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司；Beta 1-8 LD plus型冷凍干燥機，德國Marin Christ公司．

沒食子酸購于國藥上海化學試劑有限公司；DPPH、福林酚購于上海麥克林生化科技有限公司；L-抗壞血酸購于生工生物工程有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯均為分析純，購于天津市大茂化學試劑廠；Na2CO3、NaOH、HCl均為分析純．

1.3 海帶多酚的提取方法

稱取2.0 g經過預處理的海帶干粉，按照一定的料液比加入80%乙醇溶液，在一定溫度下超聲輔助提取，抽濾得到提取液和殘渣，旋蒸提取液至最小體積，得到游離多酚；向殘渣中加入 2mol/L NaOH溶液，超聲輔助提取，調節pH至2.1～2.4，經乙酸乙酯萃取后旋蒸至最小體積，得到結合多酚；將游離多酚和結合多酚分別冷凍干燥，避光保存．

1.4 海帶多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法[16]，以沒食子酸為標準品，測定海帶提取物的多酚含量．配制200 μg/mL沒食子酸標準溶液，再將標準品依次稀釋至 100、50、25、12.5、6.25 μg/mL．在 96 孔板中加入20 μL沒食子酸標準品（0～200 μg/mL）或 20 μL 樣品、20 μL蒸餾水、20 μL10%福林酚試劑，避光靜置反應10 min．再加入140 μL 7% Na2CO3溶液，避光反應1.5 h，使用酶標儀測定其在760 nm波長處的吸光度值．以沒食子酸標準溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到線性回歸方程為：Y=0.043X+0.0548，R2=0.9995．將稀釋至適量濃度待測樣品的A760nm值代入沒食子酸標準曲線方程，計算樣品多酚含量及提取率．

1.5 海帶多酚提取的單因素試驗

以2.0g海帶粉末、80%乙醇溶液、2mol/L NaOH溶液為固定水平，考察提取溫度、料液比和超聲時間對海帶游離多酚和結合多酚提取量的影響．按照下列方案進行單因素試驗：（1）設定料液比為1:30（g/mL），提取溫度分別設為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，超聲輔助提取時間為30 min；（2）料液比分別設為 1:5、1:10、1:20、1:30、1:40（g/mL），提取溫度為40 ℃，超聲輔助提取時間設為30 min；（3）設定料液比為1:30（g/mL），提取溫度為40℃，超聲輔助提取時間分別設為 20、30、40、50、60 min．以提取液中的游離多酚和結合多酚得率為考察指標．

1.6 海帶多酚提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優化海帶多酚提取工藝，各因素和水平見表1．

表1 正交試驗因素水平表

1.7 海帶多酚的體外抗氧化試驗

根據海帶多酚清除 DPPH·的能力評估其體外抗氧化活性，參考楊玉瑩等[17]方法并加以改進．配制濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL的游離多酚和結合多酚樣品溶液．將樣品與 DPPH乙醇溶液（5×10-5mol/mL）同體積混合、搖勻，避光靜置30 min，使用酶標儀測定樣品在517 nm處的吸光度值，以抗壞血酸為陽性對照．DPPH·清除率計算公式為：

式中：Ai為樣品吸光度；A0為空白對照吸光度．

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對海帶多酚提取率的影響

溫度對海帶游離多酚和結合多酚提取率的影響如圖1所示．當溫度為40℃時，游離多酚和結合多酚的提取率均達到最高值，分別為 1.56%和1.11%．隨著溫度升高，多酚提取率呈先上升后下降的趨勢，可能是溫度上升后多酚更容易溶解、擴散．然而由于多酚穩定性較低，溫度過高可能會使其發生氧化、降解等不可逆的化學反應，其結構易遭到破壞，同時也會增加成本，因此，選擇提取溫度為 30、40、50 ℃作為正交優化試驗的條件．

圖1 提取溫度對多酚提取率的影響

2.1.2 料液比對海帶多酚提取率的影響

料液比對海帶游離多酚和結合多酚提取率的影響如圖2，隨著料液比的升高，多酚提取率也會相應的增高，可能是由于溶劑對多酚未達到飽和狀態；而當料液比過高時，多酚得率呈下降趨勢，可能是溶劑含量過高導致提取不充分，且乙醇用量增加，提高成本．根據多酚的提取率及成本問題，選擇料液比為1:10、1:20、1:30（g/mL）進行正交優化試驗．

圖2 料液比對多酚提取率的影響

2.1.3 超聲時間對海帶多酚提取率的影響

超聲時間對海帶結合多酚和游離多酚提取率的影響如圖3，隨著超聲時間的延長，多酚得率呈升高趨勢，當延長至40 min時，總多酚提取率達到 2.69%；繼續延長超聲時間，多酚提取率呈下降趨勢．超聲時間較短，多酚未完全溶解擴散，造成提取不充分；超聲時間過長，多酚易被氧化或降解，影響其生物活性．根據多酚的提取率，選擇超聲時間為30、40、50 min作為正交優化試驗的條件．

圖3 超聲時間對多酚提取率的影響

2.2 正交試驗結果

在以乙醇為提取劑的基礎上，以超聲時間、提取溫度和料液比作為海帶多酚提取率的影響因素，采用三因素三水平的L9（33）正交試驗表對提取條件進行優化．正交試驗結果及分析見表2和表3．

表2 多酚優化正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析表

根據表2的極差分析可得，選定的3種因素對海帶多酚得率的影響順序為：A>B>C，即對多酚提取率影響最大的因素是料液比，其次是提取溫度，最后是超聲時間．提取海帶多酚的理論最優組合為A3B2C1，即料液比為 1:30（g/mL）、提取溫度為 40℃、超聲時間為30 min，在此工藝條件下，總多酚的提取率為2.74%．根據表3方差分析結果，表明提取溫度、超聲時間和料液比3個因素不同水平間的差異影響未達到顯著水平，各因素影響排序為A>B>C，與正交試驗結果一致．

2.3 體外抗氧化試驗結果

海帶多酚對DPPH· 的清除效果如圖4所示．隨著濃度的增加，游離多酚和結合多酚對 DPPH·的清除能力呈上升趨勢，表明其抗氧化性越強．當濃度達到2.0 mg/mL時，游離多酚、結合多酚和抗壞血酸的 DPPH·清除率分別為 41.72%、19.37%、68.93%，表明海帶游離多酚和結合多酚均具有一定的抗氧化活性，且游離多酚的抗氧化活性高于結合多酚，但均低于抗壞血酸．

圖4 海帶多酚對DPPH自由基的清除能力

3 討 論

本研究采用超聲輔助提取法提取海帶多酚，以乙醇作為提取劑，具有提取率高、成本低、易回收等優點．通過正交試驗得出提取海帶多酚的最優工藝：超聲時間為 30 min，料液比為 1:30（g/mL），提取溫度為40℃，此條件下游離多酚和結合多酚的提取率分別為 1.52%和 1.22%，海帶總多酚的提取率為2.74%．符曉杰等[18]采用80%乙醇作為浸提劑，60℃浸提3～5 h，得到海帶多酚的提取率為 1.20%，低于本實驗中海帶多酚的得率．因此，超聲輔助提取法可作為一種提取海帶多酚的有效方法．

游離多酚溶解性較好，易溶于水和有機溶劑，而結合多酚不能直接溶于有機溶劑，較難萃取．本實驗采用乙醇萃取游離多酚，再對殘渣進行堿水解，由糖苷鍵和酯鍵結合的多酚能釋放出來，可用于提取結合多酚[19]．目前，針對海帶游離多酚與結合多酚的研究較少．本研究中，海帶游離多酚的提取率和抗氧化活性均高于結合多酚，可能與多酚的組成、結構差異相關．海藻多酚含有酚性羥基，可分為褐藻多酚類、黃酮類、酚酸類和鹵代酚類，且均具有抗氧化活性[20]．海帶作為一種常見的褐藻，含有的褐藻多酚呈水溶性[21]，可能由于游離多酚中褐藻多酚含量較高，發揮了較強的抗氧化作用．海藻多酚的羥基是清除自由基的重要基團，由于其數目和取代位置的差異，導致不同多酚抗氧化能力的差別[20]．另外，在堿水解處理過程中，結合多酚成分可能發生氧化降解或結構變化導致其活性降低．因此，需通過進一步測定海帶游離多酚與結合多酚的組成成分及結構類型，以探究其抗氧化能力的具體作用機制．

近年來，隨著對合成抗氧化劑毒副作用的認識，尋找安全的抗氧化劑已成為研究熱點，而從海藻中尋找天然高效抗氧化劑已成為一種新的趨勢[22]．海帶是廣泛生長于我國海域的天然海藻，資源豐富、產量高．海帶中含有豐富的多酚類物質和較強的抗氧化活性，與合成抗氧化劑相比有著明顯的優勢，可作為潛在的天然抗氧化劑來源且具有較好的功能食品的開發價值，提升海帶資源的綜合利用水平．