長鏈非編碼RNA TTN-AS1通過miR-3928調節p38MAPK參與宮頸癌進展的機制研究

劉曉娟，謝雙雙，張 晶，康燕華

河北北方學院附屬第一醫院婦產科，河北張家口 075002

盡管新的診斷技術和治療方法不斷被應用于臨床，但是宮頸癌患者的預后仍然不令人滿意。研究發現宮頸癌的轉移和復發是引起宮頸癌患預后不佳的主要因素，p38MAPK由MAPK14基因編碼，是引起宮頸癌進展、轉移的重要蛋白[1]，但是其具體的調控機制尚不完全明確。最新研究證實了微小RNA(miRNA)與腫瘤發生和發展密切相關，miRNA可通過直接靶向靶基因的信使RNA(mRNA)誘導其講解或轉錄抑制，從而轉錄后水平上調節基因的表達從而參與腫瘤的發展[2]。miR-3928是近年來新發現的與腫瘤相關的miRNA，有研究發現下調miR-3928的水平可以促進骨肉瘤的進展，提示miR-3928具有抑癌作用[3]，但是miR-3928在宮頸癌中的作用尚不清楚。此外，miRNA的靶向作用又被長鏈非編碼RNA(LncRNA)的靶向調控，LncRNA會像“海綿”一樣吸附miRNA從而調控靶基因的表達[4]。最新研究發現TTN-AS1可通過靶向miR-4677-3p促進ZEB1基因的表達，從而發揮促進肺腺癌細胞遷移和侵襲[5]。本研究主要分析RNA TTN-AS1通過miR-3928 調節p38MAPK參與宮頸癌進展的機制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌細胞系CasKi(ATCC公司，美國)。DMEM培養基(Invitrogen公司，美國)。miR-3928類似物(mimic)、TTN-AS1和p38MAPK過表達質粒及相應的陰性對照(NC)(Thermo Fisher公司，美國)。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)。雙熒光素酶報告試劑盒和相應的熒光檢測儀(Promega公司，美國)。細胞計數試劑盒-8(CCK-8)試劑盒(Beyotime生物技術研究所，中國)。凋亡檢測試劑盒和FACSCaliburTM流式細胞儀(BD Biosciencesg公司，美國)。Transwell小室和基質凝膠(BD Biosciences公司，美國)。PCR引物由Genewiz公司(中國)設計和合成。Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)。逆轉錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR檢測系統(Life technology公司，美國)。 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液(Beyotime公司，中國)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒和電化學發光(ECL)試劑盒(北京Applygen公司，中國)。p38MAPK、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和二抗(Abcam公司，美國)。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司，美國)。

1.2生物信息學分析 通過工具網站GEPIA分析腫瘤基因組圖譜(TCGA)數據庫的宮頸癌患者TTN-AS1水平與宮頸癌進展情況和與MAPK14水平之間的關系。預測TTN-AS1靶向miR-3928和miR-3928靶向p38MAPK的結合位點。

1.3雙熒光素酶報告實驗 將細胞分為對照組和miR-3928模擬組(mimic組)，并分別通過質粒轉染NC和miR-3928mimic。在驗證miR-3928靶向p38MAPK時，分別將野生型的p38MAPK(p38MAPK-wt)或突變的p38MAPK(p38MAPK-mut)克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。然后分別通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)或蛋白質免疫印跡法(Westernblot)檢測各組miR-3928和p38MAPK的水平。

在驗證TTN-AS1時靶向miR-3928時，分別將TTN-AS1-wt和TTN-AS1-mut克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。將CasKi細胞接種在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000將克隆和突變的序列轉染至細胞中。使用熒光素酶報告檢測儀評估熒光素酶活性。

1.4qPCR檢測TTN-AS1、miR-3928和p38MAPK mRNA 通過Trizol獲得細胞中總RNA，然后驗總RNA的純度和濃度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉錄合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進行qPCR實驗(在95 ℃ 10 min，40個循環，94 ℃ 15 s，60 ℃/1 min，60 ℃ 1 min，4 ℃保存)。GAPDH作為mRNA和LncRNA的內參，U6作為miRNA的內參，通過比較循環閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達。

1.5Westernblot檢測p38MAPK蛋白的表達 在液氮下將細胞研磨，在液氮保護下使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。然后使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后轉移到PVDF膜上(50 V,120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PVDF膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內參對蛋白條帶的灰度進行定量。

1.6細胞培養、分組和轉染 將CasKi細胞在DMEM培養基中培養，37 ℃。5% CO2，相對濕度100%。將細胞分為4組，即對照組、mimic組、mimic+TTN-AS1組和TTN-AS1組。使用Lipofectamine 2000試劑盒進行瞬時轉染，其中mimic組和mimic+TTN-AS1組通過轉染miR-3928 mimic質粒以過表達miR-3928，mimic+TTN-AS1組和TTN-AS1組轉染p38MAPK質粒過表達p38MAPK。對照組轉染兩種NC質粒，在轉染24 h后收集細胞進行后續試驗。

1.7CCK-8檢測細胞活力 將細胞接種于96孔板(每孔2×104個細胞，100 μL)，在培養第48 h加入10 μL CCK-8試劑并在37 ℃下培養，通過酶標儀檢測450 nm處的吸光度計算相對細胞活力。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡率 將細胞消化后重懸，在2×105個細胞中分別加入異硫氰酸熒光素(FITC) Annexin V和7-氨基放線菌素D(7-AAD)各10 μL和5 μL，然后分別室溫、避光下分別孵育15 min，然后通過進行流式細胞術，通過配套Cell Quest軟件分析凋亡率。

1.9荷瘤裸鼠實驗 在Transwell小室的上室加入基質膠，底室加入完全培養基，然后將2×104個細胞加入至上室培養48 h。48 h后洗去未侵入底室的細胞。然后將細胞使用20%甲醇固定，并用0.2%結晶紫染色。在倒置顯微鏡下計數每個視野侵入底部室的細胞數目。

2 結 果

2.1生物信息學分析結果 在TCGA數據庫中，根據GEPIA的分析結果，發現高水平的TTN-AS1的宮頸癌患者具有更短的無進展生存期(P<0.05)，并且TTN-AS1的水平與MAPK14的轉錄水平呈正相關(r=0.320,P<0.05)。見圖1。

注：A為GEPIA數據庫中TTN-AS1表達與宮頸癌患者無進展生存期的相關性;B為GEPIA數據庫中TTN-AS1表達與MAPK14表達的相關性；TPM為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的Transcripts；HR為生存資料的效應量，比較一段時間內的風險。

2.2TTN-AS1直接靶向miR-3928 TTN-AS1靶向miR-3928的結合位點見圖2。然后通過雙熒光霉素試驗結果驗證了同時轉染NC+TTN-AS1-wt和NC+TTN-AS1-mut的細胞的熒光酶素活性分別為(1.00±0.09)、(1.04±0.12)，與miR-3928 mimic+TTN-AS1-mut比較(0.98±0.16)，miR-3928 mimic+TTN-AS1-wt細胞的熒光酶素活性顯著降低(0.34±0.04)，差異有統計學意義(P<0.05)，說明TTN-AS1直接靶向miR-3928。

2.3miR-3928靶向抑制p38MAPK的表達 miR-3928靶向p38MAPK的結合位點:MAPK14(位置6589-6595)的堿基序列5′……agccaacuggggagaGAGCUUCu……3′與miR-3928的堿基序列3′-cguccgccuuggaauCUCGAAG-5′具有結合位點。然后通過雙熒光霉素實驗結果驗證了同時轉染NC+p38MAPK-wt和NC+p38MAPK-mut的細胞的熒光酶素活性分別為(1.00±0.07)、(1.02±0.15)，與miR-3928 mimic+p38MAPK-mut比較(0.95±0.12)，miR-3928 mimic+p38MAPK-wt細胞的熒光酶素活性顯著降低(0.350±0.045)，差異有統計學意義(P<0.05)。進一步研究也發現，與對照組[分別為(3.36±0.31)、(2.83±0.34)]比較，轉染miR-3928mimic后，細胞中p38MAPKmRNA和蛋白的水平降低[分別為(0.83±0.08)、(1.27±0.14)]，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 TTN-AS1直接靶向miR-3928的結合位點

2.4各組細胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平 mimic組miR-3928水平高于對照組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。TTN-AS1組miR-3928水平低于對照組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。mimic+TTN-AS1組miR-3928水平低于mimic組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于mimic組，差異有統計學意義(P<0.05)。miR-3928對p38MAPK的抑制作用被TTN-AS1阻斷，見表1。

表1 各組細胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平比較

2.5各組細胞的細胞生長和凋亡情況比較 mimic組的細胞活力顯著低于對照組，凋亡率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，TTN-AS1組的細胞活力高于對照組，細胞凋亡率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1組的細胞活力高于mimic組，細胞凋亡率低于mimic組，差異有統計學意義(P<0.05)。過表達TTN-AS1會阻斷miR-3928對細胞生長的抑制作用和對凋亡的促進作用，見表2、圖3。

表2 各組細胞的相對細胞活力和凋亡率比較

2.6各組細胞侵襲能力比較 mimic組的細胞侵襲能力[(20.37±2.08)個]低于對照組[(37.67±3.57)個]，差異有統計學意義(P<0.05)，TTN-AS1組的細胞侵襲能力[(57.86±3.98)個]高于對照組[(37.67±3.57)個]，差異有統計學意義(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1組的細胞侵襲能力[(39.40±3.14)個]高于mimic組[(20.37±2.08)個]，差異有統計學意義(P<0.05)。過表達TTN-AS1會部分逆轉miR-3928對細胞侵襲的抑制作用，見圖4。

注：A為對照組、B為mimic組、C為mimic+TTN-AS1組、D為TTN-AS1組。

注：A為對照組、B為mimic組、C為mimic+TTN-AS1組、D為TTN-AS1組。

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，根據最近的統計報告，2018年宮頸癌新病例數為569 847例，占所有腫瘤的3.2%。并且2018年死于宮頸癌的患者共有311 365例，占所有惡性腫瘤的3.3%[6]。雖然許多早期診斷宮頸癌的新生物標志物被發現，并且靶向藥物、免疫療法等新的治療手段被不斷地應由于宮頸癌的治療，但由于腫瘤的轉移、復發和獲得性耐藥的發生，仍有一部分患者不能取得較好的預后[7]。探究宮頸癌轉移的分子機制提高是發展新的診斷和治療策略的基礎。

抑癌基因和促癌基因的異常低表達和過表達是導致腫瘤發生和進展的主要機制，p38MAPK蛋白最初在炎癥和應激反應中發現，后來被認為是一種與腫瘤相關的蛋白[8]。在宮頸癌中，p38MAPK發揮促癌作用，激活p38MAPK相關通路會促進腫瘤細胞遷移和侵襲，是宮頸癌轉移的分子機制之一[9]。并且p38MAPK蛋白的表達會受到miRNA的靶向調節，miR-374b可通過抑制p38MAPK抑制宮頸癌細胞的增殖并促進凋亡[10]。HE等[11]研究結果顯示人類早期內皮祖細胞增殖能力的升高伴隨著miR-3928水平的降低，提示miR-3928具有抑制細胞增殖的作用。XIA等[12]發現肺組織中miR-3928的表達水平與肺鱗狀細胞癌患者的惡性表型和不良預后有關。并且miR-3928 可具有直接靶向抑制Dicer 蛋白表達的作用[13]。本研究預測并驗證了miR-3928可直接靶向抑制p38MAPK的表達。

miRNA靶向mRNA的過程受到LncRNA的靶向調控。LncRNA是一類長鏈RNA，其長度超過200個核苷酸，不具有蛋白質翻譯功能。LncRNA可以通過競爭內源性RNA的方式作為“海綿”“吸附”miRNA，從而調節miRNA在mRNA降解和翻譯中的作用[14]。LncRNA通過靶向miRNA調節靶基因表達也是調節腫瘤細胞發生和發展的機制之一。本研究結果顯示發現高水平的TTN-AS1的宮頸癌患者具有更短的無進展生存期，并且TTN-AS1的水平與MAPK14的轉錄水平正相關。并且也進一步驗證了TTN-AS1與miR-3928之間存在靶向關系。TTN-AS1在多種腫瘤中發揮促癌作用，包括口腔鱗狀細胞癌、肺腺癌及前列腺癌等[15-17]。本研究結果顯示過表達TTN-AS1會顯著抑制miR-3928的水平，促進p38MAPK的表達，并阻斷miR-3928對p38MAPK的抑制作用。過表達miR-3928明顯降低了細胞活力和細胞侵襲能力。而TTN-AS1能夠上調細胞活力和細胞侵襲能力，抑制細胞凋亡。過表達TTN-AS1會顯著阻斷miR-3928對細胞生長、侵襲的抑制作用和對細胞凋亡的促進作用。FU等[18]研究顯示TTN-AS1可通過靶向抑制 miR-134-5p促進MBTD1的表達并抑制骨肉瘤細胞的凋亡和促進耐藥。JIA等[19]發現TTN-AS1可通過靶向miR-142-5p/CDK5促進肺癌細胞的遷移和侵襲。本研究結果顯示在宮頸癌中，TTN-AS1通過靶向miR-3928促進細胞生長和侵襲，抑制凋亡。

綜上所述，miR-3928靶向抑制p38MAPK的表達，TTN-AS1可通過直接靶向miR-3928上調p38MAPK的水平。TTN-AS1通過靶向調控miR-3928/p38MAPK促進CasKi細胞的增殖和侵襲并抑制凋亡。關于TTN-AS1和miR-3928在宮頸癌患者中的臨床意義值得進一步研究，關于TTN-AS1和miR-3928通過p38MAPK調節宮頸癌進展的作用尚待進一步的體內研究。