松郁安神方對PCPA致失眠大鼠睡眠時相的影響

曾雪愛 周春權 吳華嵩 黃俊山

(福建省中醫藥科學院，福州，350003)

睡眠和覺醒是人的一生中反復交替出現的2種生理狀態，但隨著現代生活節奏的加快，睡眠與覺醒的平衡常常被破壞，從而引起失眠。長期失眠不僅影響人們的生命質量和身心健康，而且常會加重或誘發心悸、胸痹、眩暈、頭痛、中風等[1]。目前，傳統鎮靜催眠藥可以改善失眠患者的睡眠，但存在耐受或依賴等不良反應[2]，近年來，對于中醫藥治療失眠開展了廣泛的研究，發現許多中草藥具有良好的鎮靜安神作用，而且不良反應小。

松郁安神方為國家重點專科(神志病)學術帶頭人、第六批全國老中醫藥專家學術經驗繼承工作指導老師、福建省名中醫黃俊山教授臨床經驗方，由甘松、郁金、玫瑰花、酸棗仁、柴胡、珍珠母、生龍骨、合歡皮、丹參組成，是臨床上治療失眠的經驗效方[3-4]。本實驗采用動物睡眠生物解析系統24 h連續記錄大鼠腦電和肌電活動，觀察松郁安神方對PCPA致失眠大鼠睡眠時相(覺醒期、非快速眼動睡眠期、快速眼動睡眠期)的影響，客觀評價松郁安神方改善睡眠的作用。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體質量(230±10)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005；合格證編號：20170005004461]。動物置于安靜、恒溫恒濕、12 h/12 h明暗光照環境中飼養，可自由飲水和進食。

1.2 試劑與儀器 PCPA(Sigma公司，批號：SHBH7873)、自凝牙托水(上海齒科材料廠，批號：01-09-15)、自凝牙托粉(上海珊瑚化工廠，批號：01-11-15)、注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠，批號：A02126012)、中藥飲片(福建鷺燕藥業股份有限公司)、動物睡眠生物解析系統(KisseiComtec，日本)、68003腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

2 方法

2.1 中藥制備 松郁安神方組成：甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、酸棗仁15 g、柴胡15 g、珍珠母30 g、生龍骨30 g、合歡皮15 g、丹參15 g。藥物經煎煮及過濾濃縮至3.4 g/mL備用。

2.2 PCPA失眠模型建立 按照參考文獻[5]的方法，于臨用前按照300 mg/kg用量，將PCPA溶于弱堿性生理鹽水，配制成混懸液，按10 mL/kg體質量腹腔注射，連續2 d，1次/d。

2.3 動物分組與給藥 將大鼠隨機分為3組：空白對照組、PCPA失眠模型組、松郁安神方組，每組4只。松郁安神方組按17 g/kg體質量灌胃給藥，空白對照組和失眠模型組均給予同等體積蒸餾水灌胃，1次/d，共7 d。

2.4 大鼠頭部電極埋植手術 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，將頭部手術區剃毛，腦立體定位儀固定。剪開皮膚，分離皮下組織，使顱骨完全暴露。分別于前囟前1.0 mm，旁開1.5 mm和后囟前1.0 mm，旁開1.5 mm鉆孔(鉆通顱骨，但未穿破硬腦膜)，將2個與采集EEG電極相連的不銹鋼螺絲固定于顱骨的鉆孔中，在后囟另一側鉆孔(未鉆通顱骨)，將一個與參比電極相連的不銹鋼螺絲固定于顱骨的鉆孔中，用牙托粉將3個電極封固于顱骨上。另外兩根采集EMG的電極分別插入兩側頸部斜方肌中。所有的電極都連接到一個微型連接器上，并用牙科水泥固定在頭骨上。縫合創口，術后腹腔注射青霉素鈉，恢復7 d后進行實驗。

2.5 大鼠睡眠時相的記錄和分析 末次灌胃給藥后，將大鼠置于記錄籠中，連接記錄系統，進行記錄。記錄時EEG和EMG信號通過大鼠頭部電極，途經多通道萬向輪，經初步放大后將信號接入到放大器。信號經濾波后，進一步放大，輸入到電腦，經模數轉換最終獲得數字信號。記錄從第1天的19:00點開始，到次日19:00點結束，連續24 h記錄自由活動大鼠的EEG和EMG。記錄結束后，用SleepSign分析軟件，根據統一設定的標準掃描記錄的EEG/EMG信號，自動判別出覺醒(W)期、NREM期和REM期。掃描完成后，進行人工檢查，必要時改正。

3 結果

3.1 注射PCPA對大鼠的睡眠時相的影響 為了檢驗PCPA失眠模型是否成功，采用動物睡眠生物解析系統記錄大鼠EEG/EMG信號。圖1是大鼠睡眠過程中的3個狀態：覺醒期(W)、非快速眼動睡眠期(S)、快速眼動睡眠期(R)。W期以高頻低幅的腦波為主，伴有明顯的肌電活動，S期以低頻寬幅的Delta波為主，EMG活動不明顯，R期以Theta波為主，EMG信號基本沒有。

圖1 大鼠各睡眠時相

大鼠給予PCPA造模后，24 h時間過程NREM、REM睡眠量和覺醒量變化情況見圖2A，大鼠晝夜12 h NREM、REM睡眠總時間和覺醒總時間見圖2B。如圖2A所示，24 h時間過程的變化表明，與正常對照組比較，失眠模型組在夜晚(19:00～次日7:00)，NREM睡眠時間在1:00時段差異有統計學意義(P<0.01)，REM睡眠時間在24:00時段差異有統計學意義(P<0.05)，覺醒時間在24:00、1:00、6:00這3個時段差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；在白天(7:00—19:00)，NREM和REM睡眠時間較正常對照組明顯減少，覺醒時間明顯增加，其中NREM睡眠時間在7:00、8:00、11:00、14:00、17:00這5個時段差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，REM睡眠時間在10:00、14:00、17:00這3個時段差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，覺醒時間在7:00、11:00、12:00、14:00、17:00這5個時段差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。如圖2B顯示，在夜晚，與正常對照組比較，失眠模型組12 h NREM睡眠總時間、REM睡眠總時間雖然減少，但差異無統計學意義(P>0.05)；在白天，12 h NREM和REM睡眠總時間較正常對照組均明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，而覺醒總時間明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖2 注射PCPA對大鼠睡眠時相的影響

3.2 松郁安神方對PCPA致失眠大鼠睡眠時相的影響 連續7 d給予松郁安神方后，如圖3A所示，24 h時間過程的變化表明，與PCPA失眠模型組比較，松郁安神方組在夜晚(19:00～次日7:00)，NREM睡眠時間在20:00、1:00、5:00這3個時段差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，REM睡眠時間在22:00、5:00、6:00這3個時段差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，覺醒時間在20:00、22:00、1:00、5:00、6:00這5個時段差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；在白天(7:00～19:00)，松郁安神方組NREM和REM睡眠時間較PCPA失眠模型組明顯增加，覺醒時間明顯減少，其中NREM睡眠時間在7:00、11:00、16:00這3個時段差異均有統計學意義(P<0.05)，REM睡眠時間在7:00、13:00、14:00、16:00、17:00、18:00這6個時段差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，覺醒時間在7:00、11:00、14:00、16:00、17:00這5個時段差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

圖3 松郁安神方對PCPA致失眠大鼠睡眠時相的影響

圖3B顯示，與失眠模型組比較，在夜晚，松郁安神方組12 h NREM睡眠總時間、REM睡眠總時間增加，其中REM睡眠總時間有統計學意義(P<0.05)，覺醒總時間則明顯減少(P<0.05)；在白天，12 h NREM、REM睡眠總時間較失眠模型組均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，而覺醒總時間明顯減少，差異有統計學意義(P<0.001)。

4 討論

松郁安神方以甘松、郁金、玫瑰花為君藥，配伍酸棗仁、柴胡、生龍骨、珍珠母、合歡皮、丹參組方，實驗室前期臨床研究證實松郁安神方治療失眠療效顯著[3-4]，動物實驗也證實它可以提高PCPA致失眠大鼠抑制性神經遞質的含量[6]，本研究旨在通過觀察大鼠EEG/EMG變化，客觀地評價松郁安神方改善睡眠的作用。

PCPA致失眠模型是目前公認的動物模型。其原理是由于PCPA是腦內色氨酸羥化酶的抑制劑，能阻滯腦內5-HT的生物合成，使5-HT的含量顯著下降，從而使動物出現完全性失眠[7]。目前腦電圖仍是評價睡眠效率的金指標。動物睡眠生物解析系統可屏蔽外界信號干擾，實時、高效、穩定、自動記錄與分析動物睡眠覺醒狀情況[8]，本研究采用此系統24 h連續記錄EEG/EMG信號，觀察大鼠睡眠過程中3個主要時期：覺醒期、非快速眼動睡眠期、快速眼動睡眠期的實時變化，結果發現腹腔注射PCPA可以降低白天(7:00～19:00)時段NREM和REM睡眠總時間，增加覺醒時間，與正常對照組有統計學差異，說明失眠模型造模成功，而連續7 d給予松郁安神方后可以明顯增加白天(7:00～19:00)時段NREM和REM睡眠總時間，降低覺醒時間，與PCPA失眠模型比較有統計學差異，表明松郁安神方具有明顯的鎮靜安神作用，其主要從通過增加白天時段NREM和REM睡眠總時間改善睡眠。