ESE3蛋白檢測在食管鱗狀細胞癌早期診斷中的作用*

盧葵花，徐俊杰，胡 鑫

(1．湖北科技學院臨床醫學院，湖北 咸寧 437100；2．湖北科技學院五官醫學院)

食管癌是我國最常見且嚴重影響人民健康水平的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于胃癌[1-2]。早期食管癌手術切除后5年生存率高，患者預后良好，而中晚期食管癌術后5年生存率低于10%，患者預后差[3-4]。迄今，食管癌的診斷方法仍以細胞學檢查和內鏡檢查為主，但其靈敏度和特異性欠佳[5]。近年來國內外學者對有關食管癌早期診斷的分子生物學標志物作了大量的研究，如腫瘤標志物P53、COX、VEGF、Fascin等，但食管癌的發生機制尚不明確，眾多標記物的敏感性、特異性還有待提高[6-9]。研究表明，上皮特異性ETS轉錄因子3(ESE3)在食管鱗狀上皮和食管鱗狀細胞癌中都有表達，ESE3蛋白在正常食管鱗狀上皮定位于細胞核，在異型增生及癌變的食管上皮中出現異常胞質定位[10]。因此，血清ESE3有可能成為食管鱗狀細胞癌早期診斷的血清學指標。本研究探討ESE3蛋白檢測在食管鱗狀細胞癌早期診斷中的作用，旨在尋找食管鱗狀細胞癌早期診斷特異性強、敏感性高的血清學標記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集于湖北科技學院附屬第一醫院和湖北省腫瘤醫院消化科和消化內鏡中心就診，且診斷為食管鱗狀細胞病變的患者87例，均于病理科留存食管病變樣本和血清標本，按病理診斷結果分為食管輕度異型增生12例、中度異型增生13例、重度異型增生15例、早期食管鱗狀細胞癌26例(均為原位癌)、進展期食管鱗狀細胞癌21例；患者年齡45～81歲；男61例，女26例。納入標準：①經病理診斷為食管異型增生或食管鱗狀細胞癌者；②入組前未接受放療或化療。排除標準：①病理診斷為食管腺癌患者；②有其他部位惡性腫瘤患者；③臨床資料不完整者。同時選取10例正常鱗狀上皮作為對照，同樣留取對應的血清標本。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色

①切片：對所有標本進行4μm連續切片；②脫蠟水化：將切片依次放入二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中脫蠟，各15min，將脫蠟后的切片按順序放入梯度酒精溶液中進行脫水，經脫蠟水化后，漂洗、加用血清封閉；③雜交：加一抗4℃冰箱孵育過夜，漂洗、甩干，滴加二抗室溫孵育30min；④染色：洗去二抗，滴加DAB顯色，清水沖洗，蘇木精復染1min，流水沖洗5min，梯度酒精脫水，封片、閱片；⑤結果判讀[11]：將ESE3蛋白定位于細胞質中呈棕色評定為陽性，隨機選取5個高倍鏡視野，其中細胞染色強度評分：無色記作0分，淡黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分；陽性細胞百分比評分：陰性記作0分，陽性細胞≤10%記作1分，陽性細胞11%～50%記作2分，陽性細胞51%～75%記作3分，陽性細胞>75%記作4分；最終染色評分結果為細胞染色強度評分與陽性細胞百分比評分乘積，對5個隨機視野的評價結果取平均值作為最終ESE3蛋白陽性率的結果。

1.2.2 ELISA方法檢測

ESE3 ELISA試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司，具有高效、靈敏、特異的抗體，具體檢測步驟如下：①標準品稀釋與加樣：收集各樣品血清，在酶標板上設置標準品孔，用標準品稀釋液對樣品進行稀釋，將樣品懸空加入酶標板底部，輕輕混勻；②溫浴：用封板膜進行封板，37°C 30min；③洗滌：甩干，每孔加洗滌液200μL，靜置30s棄液，重復5次，充分甩干液體；④加酶：每孔加入酶標試劑50μL；⑤溫浴、洗滌：操作同上；⑥顯色：每孔加入顯色劑A液50μL，顯色劑B液50μL，輕輕混勻，37°C避光顯色15min；⑦終止、測定：每孔加入終止液50μL，測定各孔吸光度。

1.2.3 各級異型增生食管、早期食管鱗狀細胞癌、進展期食管鱗狀細胞癌分組方法

對各組食管黏膜組織進行碘染色內鏡檢查，由于異常鱗狀上皮細胞中糖原含量減少或者消失，遇碘之后染色較淺或者不染色，故各級異型增生食管黏膜著色介于淺染與不染之間，表現為程度不同的淡染或者不染，輕度、中度和重度異型增生著色依次減弱；食管鱗狀細胞癌中出現斑禿樣、地圖狀不著色區域，邊緣與染色深的背景分界清楚可辨，進展期食管鱗狀細胞癌呈現多發或者主病灶延伸的不染色部位。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 ESE3蛋白在食管病變各階段的免疫組化染色情況比較

免疫組化染色結果顯示，正常鱗狀上皮細胞質中幾乎無ESE3蛋白陽性表達；ESE3蛋白在食管鱗狀細胞癌各階段均有陽性表達。ESE3在輕度異型增生中陽性表達率為16.67%(2/12)，少部分定位于細胞質；在中度異型增生中陽性表達率有所升高，為23.08%(3/13)，一部分定位于細胞質；而在重度異型增生中陽性表達率為33.33%(5/15)，絕大部分定位于細胞質；在早期食管鱗狀細胞癌以及進展期食管鱗狀細胞癌中幾乎完全定位于細胞質，陽性表達率分別為53.85%(14/26)、61.90%(13/21)，異型增生各組陽性表達率差異無統計學意義(χ2=1.03，P>0.05)，但異型增生組織陽性表達率與食管鱗狀細胞癌組織陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1(封二)。

2.2 食管鱗狀細胞癌各階段血清ESE3蛋白水平比較

ELISA結果顯示，食管鱗狀細胞癌各階段血清ESE3蛋白水平為食管輕度異型增生<中度異型增生<重度異型增生<早期食管鱗狀細胞癌<進展期食管鱗狀細胞癌，差異比較有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 食管鱗狀細胞癌各個發生發展階段血清

2.3 血清ESE3蛋白水平與食管鱗狀細胞癌不同階段的Spearman相關性分析

Spearman相關分析結果顯示，血清ESE3蛋白水平與食管鱗狀細胞癌不同階段呈顯著正相關(r=0.307，P<0.05)。

2.4 血清ESE3對食管鱗狀細胞癌的診斷價值

血清ESE3檢測食管鱗狀細胞癌的AUC為0.838(95%CI：0.750～0.926)，最佳截取值為552.15pg/mL，此值時敏感度為93.60%，特異度為70.00%，見圖2。

圖2 血清ESE3診斷食管鱗的ROC曲線

3 討 論

食管鱗狀細胞癌是一種具有高發病率和高死亡率的惡性腫瘤疾病，其早期診斷率低，食管鱗狀細胞癌每年可致高達15萬人死亡[12-13]。食管鱗狀細胞癌的組織病理類型包括鱗狀細胞癌和腺癌兩種，在我國食管鱗狀細胞癌約占全部食管癌90%以上[14]，由于早期缺乏特異性癥狀，多數食管鱗狀細胞癌患者確診時已處于腫瘤中晚期[15]。盡管近年來各種消化內鏡技術不斷發展，但患者5年生存率仍較低，給其家庭以及社會造成巨大經濟壓力[16]，而血清檢查具有無創、簡捷、費用相對較低等特點，因此，尋找能夠早期診斷食管鱗狀細胞癌的血清檢測指標具有重要意義。

ETS是轉錄因子家族中最大的家族之一，上皮組織特異性表達的ETS基因又被簡稱為ESE基因，包括ESE1、ESE2和ESE3，主要表達于上皮組織和上皮來源細胞，參與調控細胞分化與增殖[17]。既往文獻[18]研究表明，ESE3在腫瘤發生發展過程中發揮著重要作用，其在上皮組織中表達下調會影響上皮細胞正常分化過程。報道顯示[19-22]，ESE3在前列腺癌、胰腺癌中缺失表達，并作為潛在的抑癌基因發揮作用，但其在卵巢癌以及胃癌中表達升高，可作為卵巢癌預后不良的診斷指標。Li等[10]發現ESE3的核定位可以通過其過表達來恢復，ESE3重新定位可能是食管鱗狀上皮癌變的機制。本研究結果顯示，正常鱗狀上皮細胞質中幾乎無ESE3蛋白陽性表達，ESE3蛋白在食管鱗狀細胞癌各個發生發展階段均有陽性表達，其在輕度異型增生、中度異型增生、重度異型增生組織中陽性表達率依次為16.67%、23.08%、33.33%，各種異型增生類型組織中陽性表達率差異無統計學意義，但定位于細胞核數量逐漸減少，定位于細胞質數量逐漸增多；在早期食管鱗狀細胞癌以及進展期食管鱗狀細胞癌中陽性表達率分別為53.85%、61.90%，幾乎完全定位于細胞質，且食管鱗狀細胞癌組織中陽性表達率顯著高于異型增生組織中陽性表達率，差異有統計學意義(P<0.05)，表明ESE3可能參與了食管鱗狀細胞癌進展過程。ESE3在正常鱗狀上皮細胞核中表達，但定位于食管鱗狀細胞癌細胞質中，其從細胞核到細胞質的轉移可能與細胞核輸出系統飽和以及變性蛋白質相互作用有關。同時，血清ESE3蛋白在食管輕度異型增生、中度異型增生、重度異型增生、早期食管鱗狀細胞癌以及進展期食管鱗狀細胞癌各個發生發展階段的蛋白水平依次逐漸升高，表明ESE3蛋白在異型增生以及癌變的食管上皮中出現異常胞質定位，可能造成ESE3蛋白被外泌到胞外，導致血清中ESE3含量升高，其亞細胞的改變可能導致食管鱗狀細胞癌轉錄調控發生改變，進而導致食管鱗狀細胞癌發生。因此，ESE3蛋白的異常胞質定位可能是食管鱗狀細胞癌癌變過程中的早期事件。

基因表達是一個多角度、多層次的調控過程，ESE3作為一個重要的轉錄因子，在前列腺癌、胰腺癌中起著抑癌基因的作用，并被啟動子甲基化沉默，而在胃癌、乳腺癌以及結腸癌等中過度表達，并提示不良預后。本文研究結果還顯示，Spearman相關分析表明，血清ESE3蛋白水平與食管鱗狀細胞癌發生階段呈顯著正相關，表明血清ESE3蛋白水平越高，食管鱗狀細胞癌的發生風險升高。故ESE3蛋白在食管鱗狀細胞癌發生、發展過程中扮演著重要的角色，檢測其表達有可能對評估食管鱗狀細胞癌癌前病變的演變發揮重要作用。進一步ROC曲線分析結果顯示，血清ESE3檢測食管鱗狀細胞癌的AUC為0.838，敏感度為93.60%，特異度為70.00%，表明ESE3對食管鱗狀細胞癌有一定的診斷價值，其敏感性較高，但特異度稍差，作為診斷食管鱗狀細胞癌的獨立血清學指標可能還存在缺陷，但用于輔助診斷食管鱗狀細胞癌具有重要的意義。報道表明[23]，ESE3通過抑制調控半胱天冬酶3(caspase3)及其活性參與細胞凋亡調控過程，從而促進細胞凋亡。ESE3在胃癌中可能通過激活受體絡氨酸激酶家族分子EGFR/HER等分子促進細胞增殖、分化，進而抑制細胞凋亡[22]。ESE3在食管癌細胞系中過表達后，入核數量明顯增多，進而削弱了其對食管癌細胞的增殖、侵襲能力[24]。亦有研究[25]顯示，ESE1蛋白在正常食管黏膜、癌旁非典型增生以及食管鱗癌組織中陽性表達率依次升高，其異常表達與食管上皮癌變有關。但有關ESE3在食管鱗狀細胞癌發生、發生過程中的分子作用機制研究較少，我們推測ESE3蛋白的重新定位可能在食管鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移、侵襲中發揮作用，有可能是食管鱗狀細胞癌變的新機制。但本文研究尚且存在不足之處，各組收集的病例數量過少，容易出現一定程度上的結果偏差，后續還要增加病例量，開展多中心研究以提供更多的支持依據?；贓SE3在不同腫瘤中發揮出來的作用不盡相同，且國內外類似報道極少，本研究得出的僅為初步研究結果。故本研究結論尚需建立基因敲除和過表達小鼠模型對其進一步進行功能研究，其對食管鱗狀細胞癌靶基因的具體調控作用以及分子機制有待詳細闡明。

綜上所述，ESE3蛋白在食管鱗狀細胞癌細胞質內的表達顯著上調，并與食管鱗狀細胞癌發生、發展有關，可為食管鱗狀細胞癌早期診斷、預防以及治療提供科學根據。