針灸對克羅恩病患者結腸黏膜基因表達譜的影響

翁志軍,汪迪,鄭寒丹,施茵,劉雅楠,包春輝,陸嫄,吳煥淦,劉慧榮,馬曉芃,吳璐一,黃艷

(1.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437;3.上海中醫藥大學針灸免疫效應重點研究室,上海 200030)

克羅恩病(Crohn’s Disease, CD)是一種涉及胃腸道全層的慢性非特異性肉芽腫性炎癥性腸病。目前,該病病因尚不明確,與遺傳易感性、免疫、腸道菌群失調、環境、精神等多方面因素有關[1]。歐美地區發病率較高,亞洲發病率較低。有研究顯示,CD在英國發病率為 10.1/105人～11.1/105人,患病率為 55/105人～140/105人,每年大約有13 300例新發病例[2]。我國CD總體發病率及患病率分別為 0.848/105人和 2.29/105人[3],雖總體低于歐美國家,但呈上升趨勢,已成為消化系統常見的難治性疾病之一。臨床常用5-氨基水楊酸、激素、免疫抑制劑、生物制劑等為主進行治療,可較好地控制急性癥狀,誘導緩解;但撤藥時疾病容易反復發作或藥物的不良反應使臨床應用受限[4]。

針灸在治療炎癥性腸病上有不同程度的療效[5-6]。本課題組前期研究也發現,隔藥灸治療 CD療效確切,不僅可以改善輕度、中度CD患者的臨床癥狀(近期有效率為72.5%),還能降低活動期CD患者的克羅恩病疾病活動指數(CDAI),改善結腸組織炎癥,提高患者的生活質量[7-8]。相關機制研究發現針灸能通過上調 CD患者結腸上皮緊密連接蛋白的表達,修復腸上皮屏障病變,減輕腸道炎癥反應[9]。但針灸治療 CD的作用機制尚未闡明。

基因表達譜的改變和功能異常在免疫功能調節和自身免疫性疾病(包括CD)的進展中起著關鍵作用[10]。單細胞測序(single-cell RNA-seq)技術的成熟開展,能從外周血、結腸中分離的稀有細胞的層面研究 CD的發病機制,目前單細胞測序研究較多的是轉錄組學[11-12]。LncRNA/miRNA-mRNA調控網絡介導的分子機制成為 CD發病機制研究的熱點[13-14],而 messenger RNA(mRNA)作為蛋白翻譯調控的重要 RNA,實現了遺傳信息在蛋白質上的表達,能直接影響蛋白質合成和細胞表型。已有研究證實CD患者結腸炎癥部位的黏膜組織中有多種與CD相關的mRNA表達的異常[15],本課題組前期研究也發現艾灸能調控 CD大鼠結腸黏膜免疫和自噬相關基因的表達異常[16]。因此,本研究進一步采用基因芯片技術對CD進行全面的mRNA表達譜的研究,篩選出針灸治療CD患者結腸黏膜的差異表達的基因,再對差異表達的基因進行GO分析和Pathway生物信息學分析,探索針灸治療 CD的相關信號通路,以期為針灸治療CD效應機制研究提供新的研究方向,現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本研究的3名CD受試者來源于本課題組上海市針灸經絡研究所的 1項克羅恩病的臨床試驗;并在復旦大學附屬中山醫院內鏡中心招募健康受試者3名作為對照。該試驗已通過上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院倫理委員會審核。

1.2 納入標準

①符合CD的診斷標準[17];②經確診的輕度、中度CD患者(CDAI為151～450分);③前3個月未服用與本病治療相關的藥物;④同意參加本試驗并簽署知情同意書。

1.3 排除標準

1.3.1 CD排除標準

①重度CD患者或緩解期患者(CDAI＞450分或＜150分);②妊娠或哺乳期患者;③伴有心、腦、肝、腎及造血系統嚴重疾病的患者;④精神病或其他嚴重疾病患者。

1.3.2 健康受試者排除標準

腸鏡下肉眼觀察有結腸炎癥、腫瘤者。

1.4 剔除脫落標準

①誤診、誤納的患者;②依從性差或有嚴重不良反應者;③治療期間病情惡化必須實施緊急措施者;④主動退出或失訪者;⑤未能完成全部治療及隨訪者。

2 治療方法

CD患者采用隔藥灸配合針刺治療。

2.1 隔藥灸治療

取穴分2組,①天樞(雙)、氣海、水分穴;②雙側腎俞、大腸俞穴,兩組穴位交替使用。穴位定位參照《經穴部位(GB1234690)》標準。將附子、肉桂、丹參、紅花等中藥研末成粉,用黃酒調和藥粉成厚糊狀,并用模具制成直徑2.3 cm、厚約0.5 cm的藥餅。常規消毒后,將藥餅放在相關穴位皮膚上,再將高1.7 cm、重約1.8 g的艾炷(河南南陽臥龍漢醫艾絨有限責任公司)置于藥餅上,點燃艾炷后施灸,治療30 min。每日1次,每周6次,12次為1個療程,療程間休息3 d,共治療6個療程。

2.2 針刺治療

取穴分兩組,①足三里、上巨虛、曲池、合谷穴;②T6-L1夾脊穴,兩組穴位交替使用。局部常規消毒后,采用 0.30 mm×40 mm毫針直刺20～40 mm,得氣后行平補平瀉法,留針30 min。隔日1次,每周3次,兩周為1個療程,療程間休息3 d,共治療6個療程。

3 治療效果

3.1 觀察指標

3.1.1 結腸黏膜組織

所有健康志愿者及 CD患者在治療前后分別進行結腸鏡檢并采集結腸黏膜,通過結腸鏡檢查確定無任何胃腸道疾病,取距結腸息肉旁5 cm處取肉眼正常的結腸黏膜。標本離體后分裝于10%甲醛固定和凍存管,凍存管立即內置于液氮中,隨后保存于﹣80℃冰箱。

3.1.2 組織病理學觀察

將 10%甲醛溶液固定的結腸黏膜組織脫水包埋,每片切成 4 μm厚制成玻片,先脫蠟,再脫水。采用蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察結腸黏膜組織病理學改變。

3.1.3 mRNA芯片檢測及數據分析

采用Trizol方法提取總RNA,參照廠家提供的實驗方法(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行 RNA質檢,Nanodrop(ND-1000,Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)檢測其質量和定量;采用 1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察總 RNA完整性,安捷倫 2100(Agilent Technologies)進行樣本的質控,RNA integrity number(RIN)值＞7的 RNA樣本用于芯片分析。RNA樣本保存在﹣80℃冰箱備用。芯片微陣列于Affymetrix fluidics station 450中洗滌后,先用鏈霉親和素/藻紅蛋白染色。對每個樣本,用生物素化的山羊抗鏈霉親和素孵育后,再用鏈霉親和素/藻紅蛋白進行二次孵育以進一步增強信號強度,然后測量第二輪強度。使用由Affymetrix Microarray Suite軟件控制的Affymetrix掃描儀掃描微陣列。

基因芯片檢測后,使用GenePix 4000B芯片掃描芯片的熒光強度,并將實驗結果轉換成數字型數據保存,對Raw data和Clean data進行深度評估,mapping到基因組上,mapping reads數超過總reads數的90%,對基因表達水平進行標準化,得到基因的表達量。設定基因表達上調或下調為其相對表達量 Log2fold change(FC)≥|±1|,對差異基因進行篩選、聚類分析、基因本體(Gene Ontology, GO)和信號轉導通路(Pathway)富集分析研究。

3.2 結果

3.2.1 CD患者治療后結腸黏膜組織病理學比較(見表1)

表1 CD患者治療后結腸黏膜組織病理學比較

3.2.2 針灸治療CD結腸黏膜差異表達基因及聚類分析

運用基因芯片檢測健康志愿者及 CD患者治療前后結腸黏膜組織的基因表達譜。芯片結果用Limma進行統計(Linear Models and Empirical Bayes Methods for Assessing Differential Expression in Microarray Experiments),在36333個探針(NimbleGen HG 18.0)中,健康志愿者和CD患者治療前共有3449個基因存在顯著性差異,其中CD患者治療前較健康志愿者上調2250個,下調1199個;CD患者治療后與治療前有顯著性差異的基因有1926個,其中治療后較治療前上調536個,下調1390個(P＜0.05,FDR＜0.05)。

為了進一步研究各組基因表達的不同,本研究采用Venn Diagrams分析差異基因的交集。將CD患者治療前與健康志愿者差異表達的3449個mRNA和CD患者治療后與治療前差異表達的1926個mRNA取交集,發現共有388個交集基因。其中,治療后下調的差異基因與治療前相對于健康志愿者上調的表達基因共有326個;而治療后上調的差異表達基因與治療前相對于健康人下調的共表達基因有62個(見圖1A-B)。說明針灸更趨于抑制過高表達的基因。

圖1 組間差異表達基因的Venn diagrams及熱圖和聚類分析

采用Cluster 3.0和Treeview軟件對基因芯片數據進行聚類分析。將3組交集的388個基因的表達量均取10為底的對數處理,熱圖體現了CD病理狀態下上調和下調的基因在各個樣本中的表達,同時體現了針灸后這些病理改變的差異表達基因可以被逆轉(見圖1C)。聚類圖體現健康志愿者與CD患者治療后基因表達類似,而與CD患者治療前基因表達不同(見圖1D)。

3.2.3 差異表達基因篩選

由于針灸治療可調控的 CD患者治療前較健康志愿者的差異表達基因較多,本研究分別將針灸后逆轉CD病理性基因中上調的62個基因和下調的326個基因,按照 log2(FC)大小排列,前 30個差異表達基因列表見表2。其中,在 CD患者治療前表達上調,且在 CD患者治療后下調的倍數均＞3的基因有4個,即CPS1、SCIN、C12orf27和GJB1。而在CD患者治療前表達下調2倍以上,能被針灸逆轉的基因倍數＞2的基因只有CKB。詳見表2、表3。

表2 針灸逆轉的CD中前30個上調差異表達基因

表3 針灸逆轉的CD中前30個下調差異表達基因

3.2.4 差異表達基因的 Gene Ontology(GO)和Pathway功能分析

本研究對針灸后相對于 CD患者的結腸差異基因進行顯著性GO和Pathway分析。按照生物途徑,分子功能和細胞定位對基因進行注釋和分類,通過對差異表達基因進行GO terms富集度統計學的分析,其前30個GO功能富集主要體現了針灸對CD患者免疫系統、神經信號轉導、基因的轉錄調控3個方面的調節,主要包括轉錄因子STAT磷酸化、ATP酶活性、B細胞介導的免疫、自然殺傷細胞相關免疫等(見圖2)。通過將差異表達基因進行KEGG Pathway富集分析,尋找顯著性差異變化的生物學調控通路,其富集較多的前30個通路主要體現在針灸對CD患者免疫系統、基因的轉錄調控兩方面信號通路的調節,主要包括 Toll-like受體信號通路、自噬調節系統、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用(見圖3)。

圖2 CD患者治療后差異表達基因前30個GO分析

圖3 CD患者治療后差異表達基因前30個Pathway功能分析

4 討論

克羅恩病是一種自身免疫性炎癥性腸病,其關鍵作用因素尚未完全明確。基于數據庫的基因表達譜研究和蛋白-蛋白相互作用網絡已部分揭示了與CD發病機制密切相關的基因和信號轉導途徑[18]。目前,全基因組關聯性研究已經確定了170多個與CD相關的基因位點,對CD相關基因的整合和網絡分析將有助于充分明確疾病的預測基因以及了解CD的發病機制[19-20]。研究表明 CD患者結腸中有多種與炎癥相關基因的表達失調,如 C4BPB、IL1RN、CXCL1、CXCL11、MMP7、SOD2等[21]。因此,檢測和比較健康志愿者及CD患者針灸治療前后結腸中的基因差異,也有利于發現針灸可調控基因的潛在功能,從而更好地闡釋針灸的免疫效應機制。本研究運用基因芯片技術,發現CD患者治療前與健康志愿者結腸黏膜有上千個差異表達的 mRNAs,而針灸可調控CD中388個mRNA的表達。有研究通過數據庫分析鑒定出927個與CD相關的差異表達基因,其中PPAR信號通路中的LDLR、TLR2、FOXM1、NPY、LPL被認為是參與CD發病機制的重要基因[18]。Hong SN等[22]運用 RNA-seq研究了正常黏膜,非炎癥和炎癥部位的CD黏膜之間的全基因組轉錄組差異,在950個差異表達基因中,CD炎癥部位黏膜組織中 ANGPT2、CHN1、CPXM1、CPZ、CXCL1、FCN3、GJC1、HSD11B1、LZTS1、MEOX1、MMP12、PLA1A、SERPINE1、SGIP1和TRPC4等16個基因顯著上調,而 FAM189、PDE6A、SLC38A4和HMGCS2基因顯著下調。多重基因檢測發現CD患者結腸炎癥部位的黏膜組織中炎癥因子 IL17A、IL17F、IL23R、CCR6及IFN-γ的基因,編碼抗菌肽的DEFB4和HAMP基因以及REG1A、LCN2、NOS2、CXCL1-2和S100A9基因等均明顯上調[23-24]。還有研究通過定量基因表達分析了與CD相關的氧化應激和細胞凋亡相關基因,在CD病情惡化時,STAT1和PSKH1的特定表達上調,ABCB1和FASL表達下調,而在活動期患者中, FASR和NFKB1基因表達上調明顯[25]。經對比發現,本研究所得到的CD差異表達基因與以往的研究有很大不同,這可能是與檢測分析方法、樣本量的多少等因素有關。本研究可能獲得了許多新的與CD相關的基因靶點,這將為CD的機制研究提供新的思路。

針灸在治療CD上具有明顯的優勢[8-9],以往研究證實針灸能通過上調A20表達水平,抑制TNF-α介導的細胞凋亡途徑,緩解 CD腸上皮細胞凋亡的增加[26],并能調節 TNF-α-NF-κB-MLCK通路的異常激活,修復 CD腸上皮黏膜屏障[27]。本研究發現針灸可以逆轉CD患者結腸中多種差異表達的基因,筆者重點關注了上下調較顯著的前30個基因。目前這些基因與CD關系的研究較少,也尚未有針灸調控CD中這些基因表達的報道。但是,其中的 GSTA1是一種谷胱甘肽-S-轉移酶-α,大腸桿菌脂多糖刺激可以通過GSTA1加重CD結腸黏膜炎癥[28],而 TCN2基因多態性也被證實是 CD的易感基因[29]。筆者的基因芯片的結果顯示針灸可以下調 CD中GSTA1和TCN2基因的高表達。因此,針灸可能通過調控GSTA1和TCN2的表達起到緩解CD結腸黏膜炎癥的作用。但是GSTA1和TCN2具體的作用以及其他顯著差異表達基因是否在針灸治療 CD中發揮了作用還有待深入研究和證實。

研究證實多種免疫炎癥因子和免疫信號通路參與CD的發生發展,如Treg/Th17相關因子、IL-12/IL-23通路、JAK-STAT信號通路、TLR4-NF-κB信號等[30-34],自噬相關基因對CD的生理病理也有很大的影響[35]。CD結腸黏膜中的差異表達基因在通路水平的分析顯示,CD中的病毒感染和自身免疫通路明顯上調[36]。筆者也分析了針灸調控的差異顯著的前 30個上調和下調mRNA涉及的通路,發現主要有轉錄因子STAT磷酸化、ATP酶活性、B細胞介導的免疫、自然殺傷細胞相關免疫等與免疫調節相關的生物功能,并參與了 Tolllike受體信號通路、自噬調節系統、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用等與免疫炎癥相關的信號通路,這與以往研究中與 CD發生發展相關的信號通路具有一致性。因此,針灸可能通過調控關鍵mRNA的表達,影響其生物功能和與疾病相關的多種因子和免疫信號通路,從而起到改善和緩解CD腸道免疫炎癥的作用。

綜上所述,CD患者結腸黏膜組織存在基因表達譜的改變,針灸治療可以調節部分疾病狀態下差異表達的基因,其參與和涉及了多種與免疫炎癥相關的生物功能和信號通路,提示針灸能有效治療CD的機制與影響了結腸黏膜中的基因表達譜相關,主要參與細胞周期、免疫炎癥反應、細胞自噬和組織重建等生物學過程,相關的通路主要有Toll-like受體信號通路、自噬調節系統、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用。該研究結果為后期研究提供了方向,如細胞自噬的作用、免疫調節的Toll-like受體信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用等。后期可結合多組學的系統生物學研究,將轉錄組學與DNA甲基化、非編碼RNA介導的mRNA沉默、腸道菌群、組蛋白修飾、宏基因組學、代謝組學和蛋白組學等高通量測序結果結合分析,有助于探索新的作用機制。