畬藥苦爹菜增強(qiáng)免疫力功能的活性部位篩選

2021-03-19 10:06:16黃剛王華富劉麗仙桂志紅朱美曉

浙江臨床醫(yī)學(xué) 2021年2期

關(guān)鍵詞：小鼠模型

黃剛王華富* 劉麗仙桂志紅朱美曉

畬藥，主要分布在浙江省景寧畬族自治縣以及福建、江西等省的部分山區(qū)，目前已發(fā)現(xiàn)畬藥在白血病等疾病有良好的療效，苦爹菜作為一味重要畬藥，在畬藥家族中有著巨大的貢獻(xiàn)，其為傘形科茴芹屬植物異葉茴芹Pimpinella diversifolia DC.的全草［1］。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示畬藥苦爹菜研磨液可顯著提高脾淋巴細(xì)胞增殖能力及T 淋巴細(xì)胞亞群的水平，提高血清IL-2、IL-6 和TNF-α 分泌水平，本文在前期研究基礎(chǔ)上對畬藥苦爹菜的不同提取部位增強(qiáng)免疫力功能進(jìn)行研究，以期為苦爹菜生物活性成分的研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康的雄性昆明系小白鼠，為SPF 級，年齡6～8 周，體重20～24 g，購置于湖北省疾病預(yù)防控制中心，飼養(yǎng)于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（鄂）2018-0104］，小鼠在20～28℃條件下用標(biāo)準(zhǔn)鼠料及蒸餾水進(jìn)行飼養(yǎng)。鼠籠清潔1～2 次/周。鼠籠用84 消毒液進(jìn)行常規(guī)消毒。控制飼養(yǎng)房室溫在（24±26）℃，相對濕度40%～70%，音響＜60 dB，明暗周期12 h，24 h 通風(fēng)換氣。

1.2 試劑和儀器苦爹菜，18 kg，由浙江省麗水市藥檢所李水福主任中藥師/教授鑒定，采自浙江省景寧畬族自治縣，自然陰干，經(jīng)剪碎后用95%乙醇加熱回流提取3 次，2 h/次，過濾，回收溶劑，得321 g 總膏。總膏粗提物加適量水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液濃縮成浸膏得石油醚部位48 g，乙酸乙酯部位38 g，正丁醇部位85 g，水部位159 g。總膏及各極性部位均勻溶解或懸浮于蒸餾水，均配制成折合生藥材濃度約為1 g/ml 的溶液備用。環(huán)磷酰胺（100 mg），上海麥克林科技有限公司（批號：C10176816）；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒［江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（批號：20180419）］；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒［碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：C0016）］；Elisa 試劑盒（南京建成生物優(yōu)先公司），CD3-FITC、CD4-PI、CD8-PerCP；單抗（美國BioLegend 公司），酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，型號為Multuskan Go 1510），顯微鏡（Olympusix71，德國徠卡公司），流式細(xì)胞儀（FASCC，美國BD 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法（1）造模：選取健康的SPF 級小鼠100只，其中8 只為正常組，92 只經(jīng)腹腔注射35%乙醇溶解的環(huán)磷酰胺50 mg/kg 進(jìn)行造模，每隔1 天注射1 次，總共注射3 次，注射前用絡(luò)合碘進(jìn)行常規(guī)消毒，注射完畢后觀察小鼠的活動情況及死亡情況。（2）模型評判：定期觀察小鼠的日常生活癥狀，當(dāng)模型組漸漸出現(xiàn)行動遲緩、食欲不振、毛發(fā)松散且無光澤等癥狀時，可以判斷免疫缺陷動物模型初步成功；并在末次注射2 天后處死模型組小鼠與正常組小鼠及模型組小鼠各10 只，檢測胸腺及脾臟臟器重量指數(shù)，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群百分比。與正常組及溶液組比較，模型組T 淋巴細(xì)胞亞群比率下降，并且脾臟、胸腺臟器重量指數(shù)下降可以判斷免疫缺陷動物模型成立。（3）分組和給藥：選取健康的SPF 級小鼠100 只，其中8 只為正常組，92 只經(jīng)腹腔注射35%乙醇溶解的環(huán)孢菌素A 25 mg/kg 進(jìn)行造模，每隔1 天注射1 次，總共注射3 次，并選取造模成功的48 只，隨機(jī)選取8 只設(shè)為模型組，剩余40 只將其按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為A（總浸膏組）、B（石油醚部位組）、C（乙酸乙酯部位組）、D（正丁醇部位組）、E（水部位組）五組，均給予折合生藥材2 g/kg 進(jìn)行灌胃，以上藥物均給藥14 d，模型組和正常組給予生理鹽水0.2 ml 只進(jìn)行灌胃，14 d 后分別檢測細(xì)胞免疫和體液免疫的相關(guān)指標(biāo)。

1.4 檢測指標(biāo) （1）一般情況：觀察并記錄小鼠每天的飲水量、食量及體重，實(shí)驗(yàn)期間是否掉毛，被毛的光澤度，活動度，靈敏度等一般情況。（2）脾臟、胸腺指數(shù)的計算：所有動物均末次給藥后1 h 腹主動脈取血，制備含藥血清，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑪囝i處死小鼠，無菌條件下分離脾臟、胸腺。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠的體重；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/小鼠體重。（3）脾臟提取淋巴細(xì)胞：無菌條件下得到的小鼠脾臟，剔除脂肪、結(jié)締組織后用無菌手術(shù)剪剪成小塊，然后研缽中研磨，加入3 ml 的0.9%氯化鈉溶液后過濾，將過濾液1500 r/min 離心5 min，加入3 倍體積的紅細(xì)胞裂解液后重新混懸，離心后棄上清液得到沉淀細(xì)胞，用PBS 重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。（4）MTT 法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力：吸取100 μl 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，每份樣品設(shè)6 個復(fù)孔，前3 個孔分別加入50 μl ConA（終濃度為5 mg/L），后3 個孔為對照孔，每孔加入50 μl 的RPMI-1640 培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，將5×MTT 用Dilution Buffer 稀釋成1×MTT，每孔加入50 μl 1×MTT，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，使MTT 還原為甲臜。培養(yǎng)結(jié)束后，1500 r/min 離心5 min，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖10 min，在570 nm 波長處檢測每孔的光密度。淋巴細(xì)胞增殖能力=試驗(yàn)孔OD570 值/對照孔OD570 均值。（5）吞噬功能測定：小鼠腹腔注入20%（V ∶V）生理鹽水配制雞紅細(xì)胞懸液1 ml。30 min 后，頸椎脫臼處死，經(jīng)腹腔注射生理鹽水2 ml，取腹腔洗液1 ml 涂片，置37 ℃恒溫30 min，然后漂洗，晾干，以1 ∶1 丙酮甲醇溶液固定，4%（V ∶V）Ciemsa-磷酸緩沖液染色3 min，光鏡下觀察。吞噬百分率（%）=（吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)）×100；吞噬指數(shù)=被吞噬雞紅細(xì)胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。（6）T淋巴細(xì)胞百分比比較：研磨脾臟，制成細(xì)胞懸液備用，用磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/ml。取100 μl 脾臟、胸腺細(xì)胞懸液，均加入FITC 標(biāo)記的小鼠CD4 抗體、PE 標(biāo)記的小鼠CD8 抗體，4℃避光孵育1 h，加入PBS 1 ml，1200 r/min（r=8 cm）離心5 min，重復(fù)1 次，用PBS 300 μl 重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞百分率。（7）血清IL-2、Il-6 和TNF-α 水平：采用ELISA 法檢測小鼠血清IL-2、Il-6 和TNF-α 水平。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況正常組小鼠被毛光亮，活動靈活，大便棕黑色，干濕適度。模型組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后第3 天出現(xiàn)活動減少，食量下降，扎堆明顯，喜抱團(tuán)，易驚，毛色黯淡，陰囊皺縮，炸毛、掉毛現(xiàn)象。給藥一周后，A、B、C、D、E 組小鼠食量均逐漸增加，活動增多，扎堆減少，停止掉毛，毛色恢復(fù)柔順光亮。但A、C 組效果更明顯。

2.2 各組脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)比較 A、B、C、D、E各組給藥2 周后體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)均顯著高于模型組（P＜0.05），C 組給藥2 周后脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)及體質(zhì)量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余各組體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)均顯著低于正常組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)比較（±s）