基于便攜式掃描儀與智能手機的尿酸定量檢測技術

侯鵬飛，張校亮，譚 慷，李曉春

(太原理工大學 a.物理與光電工程學院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點實驗室，b.生物醫學工程學院，太原 030024)

尿酸是人體內嘌呤代謝的最終產物，健康成年人血清中正常的尿酸水平為2.5～6.72 mg/dL.尿酸水平降低往往與艾滋病、糖尿病等有關，而尿酸水平過高(高尿酸血癥)可能導致痛風、腎病等疾病[1-2]。尿酸作為一項重要的人體生理指標，對其進行定量檢測不僅可以用于疾病的診斷，也可以實現對人體健康狀況的實時監測，有助于預防疾病的進一步惡化。到目前為止，人們已經研發出多種尿酸的檢測方法比如高效液相色譜法[3]、毛細管電泳法[4]以及熒光光譜法[5]等。但這些技術往往需要精密的大型儀器輔助，檢測成本高，且操作復雜，不適用于現場快速檢測。臨床常用的尿酸檢測方法是磷鎢酸還原法，具體的檢測原理是無蛋白濾液中的尿酸在堿性環境中可以被磷鎢酸氧化成尿囊素和二氧化碳，而磷鎢酸被還原成顯藍色的鎢藍，利用分光光度計檢測710 nm處的吸收峰峰值，通過計算吸光度值的方法以實現尿酸的定量檢測。磷鎢酸還原法是一種穩定且準確的尿酸分析方法，不易受到血清中膽紅素等物質的干擾，具有較強的抗干擾能力[6]。但目前此方法在使用時同樣需要依賴分光光度計等專業設備，很難普及到普通用戶家中，也很難應用于現場快速定量檢測中。因此，目前仍缺乏適用于現場快速定量檢測人體血尿酸的方法。

比色分析作為一種方便準確的技術已經廣泛應用在檢測領域中，包括常見的尿液試紙條[7]、水質檢測卡[8]等。使用者通過人眼直接觀察或者使用顏色分析軟件對待測樣品的色度值進行分析來實現對待檢物的定性分析或定量檢測。為了提高比色分析的檢測精度與檢測速度，人們逐漸將電子產品應用其中，即利用電子設備獲取高質量的圖片，并對顯色圖像進行色度學定量分析。目前，人們已經通過使用數碼相機[9]、智能手機[7]、網絡攝像頭[10]等電子產品進行拍照分析，但這些設備存在的共同問題是在拍照過程中無法避免環境光對成像的影響，因而導致檢測結果不準確、不穩定的問題。比較之下，掃描儀因可以提供密閉空間以及均勻光源的優勢而被逐漸更多地應用于比色分析之中。

光學掃描儀在成像時可以避免環境光的干擾，此外固定且均勻的白光LED光源接近日照光，使得成像更加清晰準確。檢測者可以將96微孔板、試紙條、微流控芯片等放置于臺式掃描儀的密閉空間中實現掃描成像并達到定量檢測的目的。2009年，SOLDAT et al[11]通過用臺式掃描儀對96微孔板中顯色溶液的掃描及分析實現了對磷酸鹽等鹽溶液濃度的定量檢測。同樣2014年，CAMILO et al[12]將葡萄糖、肌酸酐以及甘油三酯顯色反應后的產物滴加在64微孔板中，結合臺式掃描儀實現了葡萄糖等三種物質的定量檢測。但臺式掃描儀結合微孔板的方法有一個明顯的不足就是微孔板對掃描儀內部空間有較大的要求，這使得普通辦公室掃描儀很難滿足條件。2015年，MENG et al[13]利用PC(聚碳酸酯)和透明PDMS(聚二甲基硅氧烷)開發了新的薄片載體，實現了對蘋果中馬拉硫磷農殘的定量檢測，該方法減小了待測液載體的體積，使得普通辦公室掃描儀也可用于比色分析的成像中。2018年，LEE et al[14]進一步改善了待測液的載體，將濾紙芯片用作檢測液載體，結合臺式掃描儀實現了人體前列腺癌細胞中H2S的定量檢測。然而，此方法雖然減小了待測液載體的體積與成本，但仍依賴于體積較大的臺式掃描儀對其進行掃描，并且依靠計算機對獲取的圖片進行分析及結果顯示，這使得此檢測方法及裝置的便攜性降低，仍然無法廣泛應用于現場快速定量檢測中。因此，解決此問題最重要的辦法是減小設備體積并簡化數據處理的過程。隨著人們對掃描儀的研究與改進，CIS(contact image sensor)便攜式掃描儀被開發并應用。不同于采用CCD(電荷耦合元件)的臺式掃描儀，CIS便攜式掃描儀的光電傳感器的長度與成像區域長度一致，且CIS便攜式掃描儀的景深較小，因此在成像過程中，CIS便攜式掃描儀距離掃描對象更近。正因如此，CIS便攜式掃描儀無需自帶密閉空間便可以避免環境光的影響[15]。另外，部分CIS便攜式掃描儀內置了Wi-Fi模塊，可以通過Wi-Fi實現與手機、計算機等電子設備的圖像傳輸，減小了掃描系統的體積并縮短了圖像傳輸的時間。因此將CIS便攜式掃描儀用于比色分析有很大的意義。

基于此，本研究使用了CIS便攜式掃描儀用于獲取高質量圖像，并設計了適用于便攜式掃描儀的濾紙芯片，結合數字圖片比色法以及磷鎢酸還原法，將掃描儀獲取的圖像通過Wi-Fi傳輸至智能手機進行分析并顯示最終的檢測結果，實現了對尿酸的快速定量檢測。此方法不僅避免了尿酸檢測對大型儀器的依賴，顯著提高了檢測方法的簡易性，而且對醫院提供的樣本的檢測結果與紫外分光光度法得到的檢測結果基本一致，證明此方法具有較高的準確性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

尿酸檢測試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)，主要成分有尿酸標準貯備液、鎢酸蛋白沉淀劑、CUT試劑和磷鎢酸試劑(CUT是一種混合溶液，其中含有碳酸鈉、硫代氨基脲等，其作用是一種促進劑，讓尿酸在堿性的環境中更加充分地還原磷鎢酸)；Whatman定性3號濾紙，Whatman纖維素層析1號濾紙(上海金畔生物科技有限公司)。

漢王E摘客便攜式掃描儀；華為暢享7 Plus智能手機；尼康COOLPIX P 310數碼相機；EPSON噴墨打印機；VCA Optima接觸角儀；中科中佳HC-2518離心機；Pipet-Lite XLS手動單道移液槍；UV-3100-紫外-可見光分光光度計(上海美普達儀器有限公司)；TKA Genpure UV超純水系統(美國賽默飛世爾公司)。

1.2 濾紙芯片的設計及制作

CIS便攜式掃描儀在掃描承載液體的載體時需要接觸載體本身，如果用便攜式掃描儀直接對顯色后的試紙條等接觸，會導致掃描儀接觸載體中的液體試劑從而影響最終的分析結果，而且會對掃描儀造成污染。為解決在掃描過程中掃描儀會接觸試劑的問題，同時也為了提高紙基的利用率并且減少制作中的復雜程度和成本，本文設計了專用的濾紙芯片。首先在計算機上的CorelDRAW軟件中，設計好濾紙芯片各部分的形狀，用噴墨打印機將設計好的形狀打印在濾紙上，然后用剪刀與打孔器沿著打印的圖形進行裁剪。設計的濾紙芯片如圖1所示，濾紙芯片由4層長度為160 mm，寬度為30 mm的濾紙組成，頂部兩層為環形的隔離層，中間鏤空區域長140 mm，寬10 mm，隔離層用于隔離掃描儀與液體試劑；第三層為顯色區，中間的圓片為反應顯色區，由打孔器(孔徑d=8 mm)裁剪濾紙得到，顯色后的試劑將滴加在中間圓片上參與之后的分析；底層為襯底層，用于避免液體試劑外漏。四層濾紙由噴膠粘合在一起。另外，整個濾紙芯片除圓片顯色區外的部分均經過疏水化處理。具體的疏水化處理過程如下：將十八烷基三氯硅烷(OTS)與甲基三氯硅烷(MTS)按體積比為3∶7混合形成疏水化試劑，將除圓片顯色區外的部分浸泡在疏水化試劑中5 min，之后室溫下風干。疏水處理后，使用接觸角儀測量濾紙的表面水接觸角θ驗證疏水效果，將疏水后的濾紙與圓片顯色區用噴膠依次粘合便可實現濾紙芯片的制作。

圖1 濾紙芯片制作示意圖

1.3 檢測原理

本文使用了自帶Wi-Fi模塊的CIS便攜式掃描儀進行圖像掃描，實驗中用到了磷鎢酸還原法的顯色原理[6]。具體操作流程及檢測原理如下。首先，配制質量濃度分別為0，1，3，5，7，9，10 mg/dL的尿酸標準樣品，并取出待檢樣品。向100 μL的標準樣和待測樣中加入鎢酸蛋白沉淀劑1 000 μL，混勻，10 min后以3 000 r/min的速度離心5 min.取上清液480 μL，加入CUT試劑150 μL，再加入磷鎢酸試劑150 μL，混勻后，靜置10 min.隨后將顯色后的標準液和待測液取出30 μL滴加在濾紙芯片上的顯色區域。使用便攜式掃描儀完成對濾紙芯片的掃描，并將獲取得到的電子圖片通過自帶的Wi-Fi模塊傳輸至智能手機。利用Java語言自主開發了可獲取圖片色度值的手機應用程序，該應用程序可以獲取顯色區域的色度值并進行分析。分析過程中，智能手機首先利用最小二乘法根據標準樣的濃度值與色度值建立線性擬合方程，然后將待測樣的色度值代入擬合方程計算出對應的濃度值，并將結果顯示到手機界面，從而實現了待測樣尿酸的定量檢測。

2 結果與討論

2.1 濾紙芯片中濾紙類型的選擇

目前常用于比色分析的濾紙類型有Whatman定性3號濾紙(Grade 3)與Whatman纖維素層析1號濾紙(Chr 1)，兩者的厚度與材料等均不相同，為了探究適用于本方法的濾紙，本文將兩種濾紙均用于尿酸分析并進行了對比，結果如圖2所示?？梢钥闯?，在0 ～ 10 mg/dL的質量濃度范圍內，定性3號濾紙芯片中Red值與尿酸質量濃度呈現較好的線性關系，而纖維素層析1號濾紙芯片中Red值在尿酸質量濃度超過8 mg/dL時已經達到飽和，這主要是濾紙厚度不同造成的，纖維素層析1號濾紙較薄(180 μm)，當滴加定量的深色試劑時更容易達到飽和，相比之下，定性3號濾紙(390 μm)的分析結果呈現的線性范圍更寬。因此，最終選擇Whatman定性3號濾紙(Grade 3)制作濾紙芯片，且定性3號濾紙經疏水化處理后，測得的表面水接觸角θ為140 °±5 °，達到了預期的疏水化效果。

圖2 纖維素層析1號濾紙與定性3號濾紙檢測結果對比

2.2 現有電子產品成像質量的對比

目前研究者們已經將智能手機、數碼相機等電子設備運用于比色分析的圖像獲取中，為了對比便攜式掃描儀與幾種現有常見電子產品的成像質量，本文對其所獲得的圖片進行了數字化分析。選擇了與尿酸顯色反應產物鎢藍顏色接近的且顏色深度按梯度變化的藍色圓點作為分析對象，用智能手機、數碼相機及便攜式掃描儀分別對其進行成像，然后在Adobe Photoshop CC 2015.5中獲取每個點的Red值，并與預設Red值進行對比。結果如圖3所示，對比可以發現，用手機及相機拍攝的照片具有明顯的背景色，且整體圖片偏暗，而便攜式掃描儀得到的圖片背景明顯接近于原始設計圖，這是因為手機與相機在拍照時會受到環境光影響，而便攜式掃描儀可以避免環境光影響；從色度值分析結果中也可看出，手機與相機成像得到的部分Red值與理論值有較大偏差，而便攜式掃描儀可以獲得與預設值相接近的測定值，且線性關系與虛線表示的理論關系基本一致。從而證明了將CIS便攜式掃描儀用于比色分析的可行性。

圖3 常見電子產品成像質量的對比及比色分析

2.3 色度值的選擇

本文對尿酸的檢測是通過色度值與濃度值的線性關系實現的，因此色度值的選擇對最終檢測結果的準確性具有重要意義。RGB色度空間作為一種常用色度空間多用于對顏色的表征，包含Red、Green、Blue三種色度值。為了從RGB色度空間中確定用于檢測尿酸的色度值，本文首先配置了質量濃度分別為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mg/dL的尿酸標準品，在完成顯色反應后，將30 μL試劑滴加到濾紙芯片的顯示區上，使用便攜式掃描儀進行掃描，掃描結果如圖4(a)所示，隨后將圖片傳輸至智能手機，利用智能手機計算顯色區的Red、Green、Blue三個色度值，并建立濃度值與三個色度值的線性關系。對比之后發現，Red值與濃度值的線性擬合系數最高，達到了0.996 0，如圖4(b)所示，這意味著Red值對尿酸濃度的變化更敏感，用Red值建立得到的擬合方程計算尿酸濃度時檢測結果也會更準確，因此選擇Red值作為檢測尿酸的分析色度值。另外，Red值與尿酸濃度值之間的擬合方程為y=-4.677 3x+252.289 7，通過擬合方程及3σ/b原則(其中σ是擬合方程中截距的標準方差，b是擬合方程的斜率)計算得到本方法的尿酸檢測限為0.8 mg/dL.

圖4 尿酸顯色后掃描圖及濃度值與三種色度值的線性關系

2.4 與分光光度方法的對比及驗證

為了進一步探究本方法的準確性，本文將此方法與分光光度方法進行了對比。首先是標準樣檢測的對比，將質量濃度分別為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mg/dL的尿酸標準品進行顯色后用便攜式掃描儀與分光光度計同時進行檢測，探究二者所得Red值與吸光度值的線性關系。隨著尿酸濃度的增大，Red值逐漸變小，而吸光度值逐漸增加，所得對比結果如圖5所示，本方法與分光光度法方法的擬合系數達到了0.984 5，說明兩種方法顯示隨著尿酸濃度的增大，吸光度值與Red值具有一致的變化趨勢，進一步驗證了本方法的準確性。

圖5 分光光度計與便攜式掃描儀檢測結果相關性

此外，本文對實際樣品在兩方法下進行了檢測及對比。樣品采用在山西白求恩醫院取得的10組血清樣本，分別用分光光度法與便攜式掃描儀檢測尿酸的濃度并進行對比，采用直接測量的方式，具體的操作過程與標準樣品操作過程相同，最終的檢測結果及對比如圖6所示。從圖中可以看出，10組檢測結果中，利用本方法檢測所得到的尿酸濃度與分光光度法得到的尿酸濃度值表現出較高的一致性，從而證明了開發的基于便攜式掃描儀結合智能手機以及濾紙芯片的尿酸濃度定量檢測方法的可靠性與準確性。

圖6 便攜式掃描儀體系與分光光度計對人體血清樣本檢測結果比較

3 結論

本文基于便攜式掃描儀和智能手機實現了人體內尿酸的定量檢測，檢測限達到了0.8 mg/dL.為了解決CIS便攜式掃描儀在掃描過程中會接觸載體中液體試劑的問題，設計并制作了適用于便攜式掃描儀的濾紙芯片。本文還對比了兩種常用于比色分析的濾紙，選擇了適用于本方法的濾紙制作濾紙芯片。在此基礎上，對比了Red、Green、Blue三種色度值與尿酸濃度的對應關系，選擇了線性關系最好的Red值作為檢測尿酸的色度值，并將Red值與分光光度計的吸光度值進行對比，證明具有較高的相關性。最后，本文還對實際血清樣品中的尿酸進行了檢測，檢測結果與分光光度法檢測結果基本一致，表明該方法可以用于人體尿酸的定量檢測。此檢測系統無需依賴大型儀器，操作簡單，檢測速度快，具有廣泛的應用前景。