‘84K’楊組氨酸激酶基因PaHK3b 的克隆及功能分析

魯俊倩，武 舒，鐘姍辰，張偉溪，蘇曉華，張冰玉

(林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

細胞分裂素是植物生長過程中的一類重要調(diào)控激素，其主要通過雙組分系統(tǒng)進行信號感知與傳遞，參與芽的分化、根的生長、種子發(fā)育等過程，且在低溫、干旱及高鹽等非生物脅迫的逆境響應中也發(fā)揮重要作用[1-4]。

植物雙組分系統(tǒng)由組氨酸激酶（Histidine Kinase，HK）蛋白、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移（Histidine Phosphotransfer，HPt）蛋白和反應調(diào)節(jié)（Response Regulator，RR）蛋白組成[5-6]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）組氨酸激酶由AHK2、AHK3和AHK4（又名CRE1）編碼，與細胞分裂素結合對下游的AHP（Arabidopsis HPts）蛋白和ARR（Arabidopsis Response Regulators）調(diào)節(jié)蛋白進行調(diào)節(jié)，進而傳遞植物激素（細胞分裂素、乙烯）和非生物脅迫信號[2,7-11]。研究表明，組氨酸激酶基因在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如AHK4對植物根的發(fā)育具有明顯的調(diào)控作用[12]，AHK3則對植物葉片的衰老和細胞分化起主導作用[13-15]，AHK2和AHK3共同調(diào)節(jié)擬南芥的種子萌發(fā)和芽的生長[16]。另外，組氨酸激酶基因在植物應對低溫、干旱及高鹽等非生物脅迫過程中也發(fā)揮重要作用[3-4]。Kang 等[17]發(fā)現(xiàn)，擬南芥ahk2和ahk3單突變體比野生型個體抗旱性明顯增強，并且ahk2/ahk3和ahk3/ahk4雙突變體比相應的單突變體抗旱。低溫脅迫時，ahk2/ahk3和ahk3/ahk4雙突變體比野生型個體具有較高的抗凍性[18]，ahk2和ahk3單突變體對干旱、鹽脅迫、低溫和強光等非生物脅迫的抗性比野生型植株顯著增強[3,18]。另外，通過萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)，ahk2、ahk3及ahk4單突變體對外源ABA 高度敏感，外源ABA 對擬南芥組氨酸激酶基因具有負調(diào)控作用[3]。通過ahk2/ahk3雙突變體和野生型植株全基因組表達分析比較發(fā)現(xiàn)，組氨酸激酶基因在植物ABA 調(diào)控的抗逆反應及非ABA 調(diào)控的抗逆反應中均起重要作用[19]。在毛果楊（P.trichocarpaTorr.&Gray）基因組中鑒定出1 個AHK2同源基因PtHK2、2 個AHK3同源基因PtHK3a和PtHK3b，研究表明，毛果楊PtHK2、PtHK3a和PtHK3b在楊樹形成層發(fā)育過程中具有重要調(diào)控作用[20]。然而，組氨酸激酶基因是否參與林木抗逆反應尚未見報道。

銀腺楊‘84K’（P.alba×P.glandulosa‘84K’）是我國從韓國引進的白楊派優(yōu)良品種，生長快、材質(zhì)好、抗性強、適應性廣，是優(yōu)良的綠化樹種、生態(tài)樹種和用材樹種，且因其易于組培及遺傳轉(zhuǎn)化，成為林木基因工程的理想材料。本研究以銀腺楊‘84K’為材料，克隆了擬南芥AHK3同源基因（PaHK3b）的啟動子及全長CDS（coding sequence），對其啟動子元件及蛋白結構域進行了分析，并對PaHK3b基因在高溫、干旱、鹽脅迫等非生物脅迫及不同植物激素處理下的表達進行了qPCR 檢測；同時，通過原核表達初步確定其生物學功能。該研究為利用組氨酸激酶基因進行楊樹抗逆分子改良奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀腺楊‘84K’。

1.2 試驗方法

1.2.1PaHK3b基因的啟動子克隆及序列分析 根據(jù)Phytozome 網(wǎng)站上公布的毛果楊基因組信息，查找基因上游啟動子序列，設計PaHK3b基因啟動子區(qū)域特異性引物PaHK3b-pro-F 和PaHK3b-pro-R（表1）。采用植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取‘84K’楊葉片總DNA，用常規(guī)PCR 方法進行目的片段擴增，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用膠回收試劑盒（Axygen，美國）回收并純化目的片段，并連接到克隆載體pMDTM19-T Vector（Takara，日本）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α（TIANGEN，北京），經(jīng)過藍白斑培養(yǎng)基（Amp+）篩選，挑取陽性單克隆送至生物公司（中美泰和，北京）進行序列測定。利用在線軟件plantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析該基因啟動子中含有的順式作用元件。

1.2.2PaHK3b基因CDS 的克隆及序列分析 采用EASY spin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒（Aidlab，北京）提取‘84K’楊葉片總RNA，并用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（takara，日本）試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成單鏈cDNA。根據(jù)Phytozome 網(wǎng)站上公布的毛果楊基因組信息，設計PaHK3b基因全長cDNA 的PCR 擴增引物PaHK3b-F 和PaHK3b-R（表1），以單鏈cDNA 為模板進行PCR 擴增，擴增程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 3 min，38 個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保溫。用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用膠回收試劑盒（Axygen，美國）回收純化目的片段，并連接到克隆載體PLB-Vector（TIANGEN，北京）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂含抗性（Amp+）平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆送至生物公司（中美泰和，北京）進行序列測定。利用在線軟件ExpasyProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對PaHK3b基因序列特征進行分析，使用GOR4 在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl)進行蛋白的二級結構進行預測，利用NCBI 在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白結構域分析。

1.2.3 ‘84K’楊非生物脅迫處理和激素處理 將帶有頂端的‘84K’楊組培苗嫩莖（2～3 cm）切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基 (1/2MS+0.02 mg·L?1NAA+0.05 mg·L?1IBA)中，培養(yǎng)于溫度24℃、光周期16 h/8 h（光照/黑暗）、光照強度為50 μmol·m?2·s?1人工氣候培養(yǎng)室，28 d 后，選取生長狀態(tài)一致的組培苗，轉(zhuǎn)移到裝有5 mL 1/2MS 液體培養(yǎng)基的玻璃管（直徑4 cm，高20 cm）中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，進行非生物脅迫處理和植物激素處理。非生物脅迫處理分別為42℃高溫、0℃低溫、200 mmol·L?1NaCl 和5% PEG6000 處理，植物激素為脫落酸（ABA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA）、赤霉素（GA3）及水楊酸（SA），濃度均為10 μmol·L?1。NaCl、PEG6000 及植物激素處理方法為將藥劑添加到1/2MS 液體培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)于1/2MS 培養(yǎng)基中的組培苗為對照。各處理的時間均為3 h，每個處理3 個生物學重復，處理后取成熟葉片，液氮速凍保存于 ?80℃超低溫冰箱。

表1 相關引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 The sequences and PCR product size of primers used in this study

1.2.4PaHK3b基因的表達分析 提取‘84K’楊根、莖、葉以及不同處理植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設計PaHK3b基因?qū)崟r定量PCR（qRT-PCR）引物PaHK3b-q-F 和PaHK3b-q-R（表1）。將合成的cDNA 稀釋10 倍作為實時定量PCR 模板，參照TB Green TM Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）（TaKaRa，日本）試劑盒說明配制反應體系：TB Green Premix TaqII（TliRNaseH Plus，2 × ）10 μL，Primer-F(10 μmol·L?1) 0.8 μL，Primer-R(10 μmol·L?1) 0.8 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 補足至20 μL。用Roche Light Cycle 480Ⅱ型熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）進行qRTPCR 反應，反應程序為：預變性95℃30 s，變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，40 個循環(huán)；溶解曲線為95℃ 5 s，65℃ 1 min。以Actin為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCT算法計算PaHK3b基因的相對表達量[21]。利用Excel2010 和Spass23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行整理制圖和差異分析。

1.2.5PaHK3b基因原核表達載體的構建 根據(jù)TIANGEN 公司在線無縫克隆引物設計工具（http://123.56.75.19）設計含酶切位點的原核表達載體引物pET-28a-PaHK3b-F 和pET-28a-PaHK3b-R（表1），PCR 擴增‘84K’楊PaHK3b基因的cDNA 序列，回收擴增產(chǎn)物。原核表達載體pET-28a（索萊寶，北京）經(jīng)Hind III（Thermo Fisher Scientific，美國）單酶切，膠回收純化，根據(jù)EasyGeno 快速重組克隆試劑盒（TIANGEN，北京）操作流程，將二者回收產(chǎn)物進行重組反應，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，經(jīng)抗性（Kan+）篩選，挑取單克隆進行PCR 驗證，并送至生物公司測序驗證，提取陽性菌株質(zhì)粒，獲得重組載體（pET-28a-PaHK3b）并轉(zhuǎn)化至表達菌株BL21（DE3）（TIANGEN，北京）。

1.2.6 重組菌E.coliBL21（pET-28a-PaHK3b）的鹽及干旱脅迫處理 將轉(zhuǎn)化后的表達菌株BL21（DE3）接種于5 mL 含有50 mg·L?1的卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩培養(yǎng)至OD6000.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol·L?1的IPTG 誘導4 h，稀釋菌液104倍，取5 μL 至含有0、50、100、150、200 mmol·L?1NaCl LB 固體培養(yǎng)基上涂抹直徑約為1 cm的9 個點，超凈臺吹干菌液，37℃倒置過夜培養(yǎng)[22]。同時，取誘導后的產(chǎn)物1 mL 加入到1 mL 含有PEG6000 的LB 液體培養(yǎng)基中使PEG 終濃度為5%（W/V），放置37℃搖床震蕩培養(yǎng)，0～7 h 內(nèi)每隔1 h 測1 次OD600值，每個時間點測3 個重復[23-25]。

2 結果與分析

2.1 ‘84K’楊PaHK3b 基因CDS 和啟動子的獲得及生物信息學分析

通過PCR 擴增、克隆得到‘84K’楊PaHK3b基因全長CDS。CDS 全長為3 060 bp，編碼1 019 個氨基酸，蛋白分子量為113 564.85 kDa，等電點為6.53，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為37，為穩(wěn)定蛋白；脂肪族指數(shù)為92.31，蛋白疏水性平均值為?0.088。蛋白主要以無規(guī)則卷曲為主，α-螺旋與延伸鏈則散布在蛋白中，其中，無規(guī)則卷曲416 個(40.82%)、α-螺旋377 個(37%)、延伸鏈則有226 個(22.18%)。蛋白結構域分析結果表明，PaHK3b 蛋白具有典型的細胞分裂素受體結構域，包含CHASE (Cyclaseand histidine kinase associated sensing extracellular)結構域、HisKA (His kinase A domain)結構域及REC(CheY-homologous receiver domain)結構域，其中，CHASE 結構域使細胞分裂素與其相應的受體結合，HisKA 結構域感知信號和His 殘基自身磷酸化，REC 結構域與磷酸基團相結合，并向下游的信號蛋白進行傳遞。

克隆得到全長1 600 bp 的‘84K’楊PaHK3b基因啟動子序列，并采用plantCARE 對其進行生物信息學分析。結果表明：PaHK3b啟動子不僅具有TATA-box 和CAAT-box 核心基本元件，還包括G-box、GA-motif、TCT-motif 等光響應元件。另外，PaHK3b啟動子區(qū)域還包含多個與逆境響應及激素調(diào)控相關的順式作用元件，如低溫響應元件LTR、防御與脅迫響應元件TC-rich repeats、赤霉素響應元件GARE-motif、水楊酸響應元件TCAelement 等（表2），表明該基因可能參與楊樹逆境脅迫及激素信號響應。

表2 PlantCARE 預測PaHK3b 啟動子的主要順式作用元件Table 2 The main cis-elements in PaHK3b promoter predicted by PlantCARE

2.2 ‘84K’楊PaHK3b 基因器官表達差異性

采用qRT-PCR 技術對‘84K’楊PaHK3b基因在根、莖、葉的表達進行檢測。結果表明：該基因在根、莖、葉中均有表達，以根表達量作為參照，莖表達量低于根組織，為根表達量的82%，葉片的表達量高于根，為根表達量的1.63 倍（圖1）。以上結果表明，PaHK3b基因在‘84K’楊葉片表達量最高。

圖1 ‘84K’楊PaHK3b 基因在根、莖、葉片中的表達差異Fig.1 Expression difference of PaHK3b gene in root，stem and leaf of ‘84K’ poplar

2.3 非生物脅迫下‘84K’楊PaHK3b 基因的表達情況

高溫、低溫、鹽脅迫和干旱脅迫條件下，‘84K’楊PaHK3b基因表達量均明顯高于對照，并且溫度脅迫下PaHK3b基因表達量高于鹽脅迫和干旱脅迫下的表達量（圖2），其中，42℃高溫脅迫、0℃低溫脅迫時，PaHK3b基因表達量分別為對照的2.67、2.61 倍；200 mmol·L?1NaCl 脅迫、5%PEG6000 脅迫時，PaHK3b基因表達量分別為對照的2.28、1.87 倍。以上結果說明，PaHK3b基因參與了非生物脅迫響應，在楊樹的逆境脅迫反應過程中起作用。

圖2 非生物脅迫處理下‘84K’楊葉片PaHK3b 基因的表達差異Fig.2 Expression difference of PaHK3b in leaf of ‘84K’poplar under abiotic stresses

2.4 ‘84K’楊PaHK3b 基因?qū)ν庠瓷L素及細胞分裂素處理的表達反應

圖3 表明：PaHK3b基因?qū)Σ煌参锛に氐捻憫胁町悺ＩL素IBA 處理時，PaHK3b基因表達量與對照相似，而其他激素處理時，PaHK3b基因表達量均不同程度的低于對照，其中，6-BA、ABA、GA3、SA 處理時，PaHK3b基因表達量分別為對照的35%、39%、61%、66%。可見，外源赤霉素、脫落酸、細胞分裂素及水楊酸均能抑制楊樹PaHK3b基因的表達，表明PaHK3b基因參與植物激素響應。

圖3 不同植物激素處理下‘84K’楊葉片PaHK3b 基因的表達差異Fig.3 Expression difference of ‘84K’PaHK3b under several plant hormone treatments

2.5 重組菌E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）的抗逆檢測

利用斑點法對PaHK3b基因的抗鹽性進行了檢測。結果表明：在未添加NaCl 的LB 固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)入pET-28a-PaHK3b重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 菌株（重組菌株）與轉(zhuǎn)入pET-28a 空載體的菌株（對照菌株）生長速度基本一致。在含有50、100、150 mmol·L?1的NaCl LB 固體培養(yǎng)基上，重組菌株與對照菌株生長均受到抑制，且隨著NaCl 濃度的增加菌落生長減少；但重組菌生長速度較對照快，菌落多且菌斑大。當培養(yǎng)基中NaCl 濃度為200 mmol·L?1時，2 種菌株均停止生長（圖4）。因此，PaHK3b基因通過原核表達能夠提高大腸桿菌菌株的抗鹽能力。

圖4 大腸桿菌E.coli BL21（pET-28a）和E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）菌株耐鹽性差異Fig.4 Difference in salt tolerance of E.coli BL21（pET-28a）and E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）

利用PEG 模擬干旱脅迫對PaHK3b基因的抗旱性進行評價，結果表明：在LB 液體培養(yǎng)基中，重組菌株的生長速度較對照菌株要快；在添加5%PEG6000 的LB 液體培養(yǎng)基中，重組菌株和對照菌株生長均受到抑制。培養(yǎng)1 h 時，重組菌株和對照菌株生長沒有差異，之后轉(zhuǎn)入pET-28a-PaHK3b重組質(zhì)粒的菌株較轉(zhuǎn)入pET-28a 空載的大腸桿菌生長速度快，培養(yǎng)7 h 后，含重組質(zhì)粒菌株的OD600值是初始的1.8 倍，含空載質(zhì)粒菌株的OD600值是初始的1.1 倍（圖5）。因此，PaHK3b基因原核表達不僅能夠提高大腸桿菌菌株生長速度，而且還能夠提高其抗脫水能力。

圖5 大腸桿菌E.coli BL21（pET-28a）和E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）菌株在LB 及LB-5%PEG6000 液體培養(yǎng)基生長曲線Fig.5 Growth curve of E.coli BL21（pET-28a）and E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）in LB and LB-5%PEG6000 liquid medium respectively

3 討論

組氨酸激酶基因在植物激素信號響應及非生物逆境脅迫響應中發(fā)揮重要作用[3,26]。如擬南芥組氨酸激酶AHK3參與其對干旱、高鹽及冷脅迫的抗逆反應[3-4]，轉(zhuǎn)玉米（Zea maysL.）組氨酸激酶基因ZmHK9的擬南芥抗旱性明顯增強[27]。本研究中，在高溫、低溫、高鹽和PEG 模擬干旱等處理條件下，PaHK3b基因表達量均增加，其中，基因上調(diào)程度呈高溫>低溫>鹽脅迫>干旱脅迫的模式；在6-BA、ABA、GA3 及SA 處理條件下，PaHK3b基因表達量均下降，基因下調(diào)程度呈6-BA>ABA>GA3>SA 的模式。因此表明，PaHK3b基因能夠不同程度的參與植物激素信號響應及非生物脅迫信號響應。另外，SA 是植物防衛(wèi)反應的重要內(nèi)源植物激素，作為一種信號分子，在植物生物脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用[28-29]。ABA 在植物抗逆脅迫反應及在生物脅迫和非生物脅迫中均具有重要調(diào)控作用。因此，PaHK3b基因可能通過ABA 及SA 途徑的負調(diào)節(jié)提高了楊樹對逆境脅迫的耐受性。

通過分析PaHK3b基因CDS 序列發(fā)現(xiàn)，‘84K’楊組氨酸激酶PaHK3b 蛋白具有典型的CHASE 細胞分裂素受體結構域。在植物外源激素6-BA 處理下，PaHK3b基因下調(diào)表達，表明該基因能夠感知細胞分裂素信號并參與響應，這與組氨酸激酶基因具有CHASE 結構域，通過該結構域與細胞分裂素的結合，感知植物激素信號并進行傳導是一致的[7,10]。對PaHK3b基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含低溫響應、防御與脅迫響應、赤霉素響應、水楊酸響應等多個參與脅迫響應及激素調(diào)控的順式作用元件。這與組氨酸激酶基因啟動子區(qū)域有多個植物激素信號響應及非生物逆境脅迫相關的順式作用元件是一致的[30-31]。另外，結合在植物激素6-BA、ABA、GA3、SA 和非生物脅迫高溫、低溫、高鹽、PEG 處理下，PaHK3b基因均不同程度參與響應的表達，表明PaHK3b基因參與植物激素信號響應及非生物脅迫響應與其基因結構密切相關。

已有研究表明，通過構建基因的原核表達載體，并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)可以對基因的功能進行初步鑒定。如將小麥（Triticum aestivumL.）脫水蛋白編碼基因——DHN14基因的原核表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，大腸桿菌菌株對重金屬脅迫及過氧化氫脅迫的耐受性顯著增強，推測小麥脫水蛋白基因DHN14在其響應非生物脅迫的過程中起作用[23]。轉(zhuǎn)入谷子（Setaria italicaL.）類受體蛋白激酶基因SiRLK35原核表達載體的大腸桿菌菌株生長狀態(tài)較陰性對照好，同時獲得的轉(zhuǎn)SiRLK35基因水稻植株對鹽脅迫的耐受性高于對照[22]。以上研究說明，原核表達結果能對克隆基因功能進行有效鑒定。在本研究中，轉(zhuǎn)入PaHK3b基因原核表達載體的菌株在50～150 mmol·L?1NaCl 的LB 固體培養(yǎng)基及5% PEG6000 的LB 液體培養(yǎng)基中生長狀態(tài)均好于轉(zhuǎn)入空載體的對照菌株。因此可得，楊樹PaHK3b基因能夠促進大腸桿菌的生長，同時能夠提高其耐鹽和抗旱能力，推測該基因可能在楊樹生長及抗逆境脅迫的過程中發(fā)揮作用。

4 結論

本研究從‘84K’楊中克隆了組氨酸激酶基因PaHK3b及其啟動子，生物信息學分析表明，該基因編碼蛋白具有典型的細胞分裂素受體結構域，其啟動子區(qū)域有多個參與脅迫響應和激素信號轉(zhuǎn)導的順式作用元件。在高溫、低溫、高鹽和PEG 模擬干旱等非生物脅迫下，PaHK3b基因表達量增加，而在6-BA、ABA、GA3 及水楊酸等植物激素處理條件下，其表達量下降。原核表達PaHK3b基因可以提高受體大腸桿菌的生長及抗旱耐鹽能力。初步生物學功能研究表明，該基因參與楊樹植物激素信號響應，并在其抗逆境脅迫過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結果為深入研究PaHK3b基因在激素信號轉(zhuǎn)導及逆境脅迫下楊樹生長發(fā)育的調(diào)控作用提供線索，為楊樹抗逆分子育種及品種改良奠定基礎。