2種花楸果實類胡蘿卜素成分與果色關系

于雪丹，張川紅＊，鄭勇奇，夏新合，黃 磊

(1. 中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091；2. 河北省小五臺山國家級自然保護區管理中心，河北 蔚縣 075700)

果色是果實品質的重要指標和影響商品價值的重要因素，是育種者和消費者共同關注的一個重要性狀[1]；同時，對于以食果動物為傳播媒介的植物來說，果色還是影響物種分布和演化的重要因素之一[2-4]。鑒于果色及其物質基礎在植物生長發育、果實品質、膳食營養和疾病健康等方面的重要性，植物果色的形成機制及調控始終備受關注和重視，對植物果色性狀的改良也是育種者始終追求的目標之一。

植物呈色的物質基礎是植物色素，主要包括葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜素。葉綠素的主要功能體現在通過光合作用促進植物生長發育，后三者則在植物體中以次生代謝物形式存在，結構和功能多樣[5]，其中，類胡蘿卜素是自然界廣泛存在的一類脂溶性萜類化合物，是人類和動物食物營養的重要來源，是維生素A 合成的前體物質[6-7]，其自由基清除能力和抗氧化活性有助于預防和治療各類癌癥、心血管疾病、呼吸系統疾病和眼病等[8-10]。在植物中，類胡蘿卜素作為次生代謝物參與植物生命過程，具有重要的生物學功能[11-13]。在植物綠色組織中，類胡蘿卜素作為基礎性代謝物其成分和積累量相對穩定[11]，在植物非綠色組織中，類胡蘿卜素作為特化性代謝物在物種間甚至物種內存在巨大差異，其大量積累使許多花、果實和根呈現鮮艷的橙色、黃色和紅色[14]。研究表明，許多重要經濟作物的果色形成均與類胡蘿卜素大量積累有關[5,14-17]。在過去10 年里，超過40 個涉及類胡蘿卜素生物合成的功能基因和轉錄調控因子已經從不同的物種和組織類型中被鑒定出來[18]，但幾乎每個研究物種、每類組織類型都利用了不同的轉錄調節組來進行類胡蘿卜素的生物合成[19]。

花楸屬（SorbusL.）隸屬薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），廣泛分布于北溫帶，全球有260 余種[20-25]，有較高的觀賞、食用和藥用價值[23,26-32]。花楸屬植物果色變異豐富，有學者認為花楸果實顏色是最重要的形態學分類性狀[20,23]，因此，花楸屬非常適合用于研究植物果實顏色多樣性的形成機制。一些花楸屬植物及品種果實中富含大量類胡蘿卜素，主要成分為β-胡蘿卜素[33-34]，果實的著色程度通常與β-胡蘿卜素的積累量正相關[35-36]，但關于花楸果色形成機制的研究鮮有報道。

我國花楸屬植物有70 余種[22-23,25]，是全球該屬資源最豐富的國家之一[37-38]。花楸樹（S.pohuashanensis(Hance) Hedl.）和北京花楸（S.discolor(Maxim.) Maxim.）分別為花楸屬復葉組（Sect.Sorbus）百華系（Ser.PohuashanensesYü）和兩色系（Ser.DiscoloresYü）喬木，是我國北方分布范圍較廣的兩個花楸屬物種[22]，二者有重疊分布[22,39]。花楸樹是一種極具觀賞、食用及藥用等開發利用價值的鄉土樹種[40-41]，北京花楸則可做為改良花楸耐日灼性的優良育種材料。筆者前期對花楸樹和北京花楸成熟果實所含營養物質和藥用成分進行了比較分析，發現果色為紅色或桔紅色的花楸樹中類胡蘿卜素積累量顯著高于果色為白色的北京花楸[41]，但對類胡蘿卜素主要成分及其積累模式與果色關系并不清楚。

液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）能精確定量類胡蘿卜素，被廣泛應用于檢測植物果實類胡蘿素與植物果色形成相關性等方面的研究[16-17,42]。因此，本研究利用LC-MS/MS 的方法，對花楸樹和北京花楸果實發育不同階段的類胡蘿卜素成分進行定性定量檢測，分析花楸樹和北京花楸果實中類胡蘿卜素積累模式差異及其與果色形成的關系，有助于揭示花楸果色形成機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇天然共同分布于河北駝梁山的花楸樹（簡稱SP）和北京花楸（簡稱SD）為研究對象。為了分析果實不同發育階段果色的變化與類胡蘿卜素積累模式的關系，需分別對類胡蘿卜素積累量的時序差異和種間差異水平進行比較分析，具體比較分組設計為：分別對每種花楸各自果實發育3 個不同階段的樣本進行兩兩比較分析；再分別對每個果實發育時期2 種花楸進行種間比較分析。因此，依據果色變化，分別在2018 年9 月1、14、30 日對花楸樹和北京花楸3 個不同發育階段的果實進行采樣，每次分別隨機選擇花楸樹和北京花楸各9 株生長良好的植株，每株樹均采集向陽面無明顯病蟲害的果實10 個，分別將每種花楸每3 個隨機組合的植株果實進行混合作為1 個檢測樣本重復，每個階段每種花楸各3 個生物學重復，3 個階段2 種花楸共計18 份果實供試樣本。采集的果實材料快速用無菌水清洗、擦干并立即投入液氮保存以備后續試驗使用。

采集的果實樣本果色時序變化（圖1）表明：發育階段A 的2 種花楸果實均沒有完全褪綠，花楸樹果實為黃綠色，北京花楸果實為淺白綠色；發育階段B 的2 種花楸果實均已褪綠，花楸樹果實為淺橙黃色，還未呈現為成熟的顏色，北京花楸果實為白色，已經是成熟的顏色；發育階段C 的花楸樹果實基本成熟，果實為桔紅色，北京花楸果實維持白色。

圖1 花楸樹(SP)與北京花楸(SD)3 個發育階段的果實Fig.1 The fruits from S.pohuashanensis(SP) and S.discolor (SD) at three different developmental stages

1.2 類胡蘿卜素提取

采用改良Xiong 等[43]的方法提取18 個供試的花楸果實樣本及對照番茄果實樣本的類胡蘿卜素，抽提時間為20 min，重復抽提1 次，復溶后過0.22 μm 濾膜，保存于棕色進樣瓶，用于LC-MS/MS 分析。

1.3 定性定量分析

1.3.1 色譜質譜采集條件 采用高效液相色譜儀（HPLC, Shim-pack UFLC140 SHIMADZU CBM30A system; Shimadzu，Kyoto，Japan）串聯質譜儀（MS,6500 Q TRAP; Applied Biosystems, Foster City，CA，USA）的方法對植物中主要的18 種類胡蘿卜素進行定性和定量分析，其中，八氫番茄紅素和六氫番茄紅素為無色類胡蘿卜素，其余16 種為顯色類胡蘿卜素。液相色譜條件根據Geyer 等[44]的方法進行優化。回收率驗證該方法符合國家標準GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》和GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》。

色譜柱，YMC C30（3 μm，2 mm×100 mm）；流動相A：甲醇和乙腈體積比3:1 加入0.01%BHT，加入0.1%甲酸；流動相B：甲基叔丁基醚加入0.01%BHT；洗針液：甲醇；洗脫梯度：0 min 100∶0（V/V），3 min 100∶0（V/V），6 min 58∶42（V/V），8 min 20∶80（V/V），9 min 5∶95（V/V），10 min 100∶0（V/V），11 min 100∶0（V/V）；流速0.8 mL·min?1；柱溫28℃；進樣量2 μL。

質譜條件主要為：大氣壓化學離子源（Atmospheric pressure chemical iosziaa-lion，APCI）溫度350℃，簾氣（Curtain gas，CUR）25 psi。在Q-Trap 6500 中，根據優化的去簇電壓（Declustering potential，DP）和碰撞能（Collision energy，CE）對每個離子對進行掃描檢測。

1.3.2 標準品數據庫 本研究采用外標法進行定性定量分析。分別配制不同濃度的類胡蘿卜素標準品（色譜純，BioBioPha，Sigma-Aldrich）溶液，根據1.2 色譜質譜采集條件，獲取各個濃度標準品對應的質譜峰出峰條件和信號強度等信息，構建類胡蘿卜素定性分析數據庫，繪制不同類胡蘿卜素的標準曲線，用于定量分析[45]。

1.3.3 供試樣本定性定量分析 依據1.2 色譜質譜采集條件對全部樣本進行LC-MS/MS 分析。利用軟件Analyst 1.6.3 分析質譜數據[45]。根據類胡蘿卜素保留時間與離子對的信息，對每種類胡蘿卜素在不同樣本中檢測到的質譜峰進行校正，以確保定性定量的準確。通過對每個樣本質譜檢測分析的總離子流圖進行重疊展示分析，判斷類胡蘿卜素檢測的可重復性。

根據類胡蘿卜素標準品離子對數據庫，對質譜檢測的數據進行定性分析。根據標準曲線得到線性方程，將類胡蘿卜素的積分峰面積代入標準曲線線性方程進行計算，得到測定樣本中類胡蘿卜素的絕對含量數據，并分析類胡蘿卜素主要成分。

1.4 類胡蘿卜素積累模式差異分析

采用差異倍數（fold change, FC）和t檢驗結合的方法對類胡蘿卜素積累量的時序和種間差異分別進行分析。類胡蘿卜素的差異顯著性篩選標準為FC≥2 或≤0.5，并且P≤0.05[16-17,42]。當FC>1時，表明vs 后的樣本比vs 前的樣本中類胡蘿卜素積累量增加；當FC<1 時，表明vs 后的樣本比vs 前的樣本中類胡蘿卜素積累量減少。結合樣本果色性狀，進一步分析類胡蘿卜素積累模式與花楸果色變化的關系。

2 結果與分析

2.1 兩種花楸果實類胡蘿卜素定性比較分析

對18 種類胡蘿卜素的定性分析表明，花楸樹與北京花楸果實中類胡蘿卜素成分分別為12 種和7 種（表1），六氫番茄紅素、ε-胡蘿卜素、花藥黃質、蝦青素、辣椒紅素以及辣椒玉紅素這6 種類胡蘿卜素在2 種花楸果實發育的3 個階段中均未檢測到。在花楸樹果實發育3 個階段均檢測到10 種類胡蘿卜素：八氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質、玉米黃質、紫黃質、γ-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、α-隱黃質、葉黃素和β-阿樸胡蘿卜素醛。在北京花楸果實發育3 個階段均檢測到6 種類胡蘿卜素：β-胡蘿卜素、β-隱黃質、玉米黃質、紫黃質、八氫番茄紅素和葉黃素。新黃質僅在花楸樹果實發育階段A 中檢測到，番茄紅素僅在花楸樹果實發育階段C 中檢測到；γ-胡蘿卜素僅在北京花楸果實發育階段B 中檢測到。

2.2 兩種花楸果實類胡蘿卜素積累模式差異及其與果色關系分析

2.2.1 花楸樹果實類胡蘿卜素積累量時序差異 花楸樹果實發育3 個階段顯色的類胡蘿卜素比例較高（圖2），其中，β-胡蘿卜素在果實發育階段A、B、C 的積累量分別為33.40、51.93、81.40 mg·kg?1（表1），其比例也逐漸升高（圖2），分別為54.68%，70.97%和79.36%。FC（表2）和t檢驗（表3）分析表明：積累量隨果實發育時序性顯著增加的β-胡蘿卜素是花楸樹果實類胡蘿卜素的主要成分，其次是β-隱黃質，其積累量分別為1.58、6.04、8.28 mg·kg?1（表1），比例分別為2.59%、8.26%和8.07%（圖2），時序性增加顯著（表2）；葉黃素、玉米黃質和紫黃質積累量（表1）和比例（圖2）時序性下降，其中葉黃素積累量從17.93 mg·kg?1下降到1.67 mg·kg?1（表1），比例從29.36%下降到1.63%（圖2），時序差異顯著（表2），對花楸樹果實發育初期果色可能有一定影響；花楸樹果實發育3 個階段，其它8 種類胡蘿卜素積累量和比例均較低（表1），對果色影響較小。無色的八氫番茄紅素積累量時序性顯著增加（表2），其比例先升高后降低（圖2）。因此，花楸樹果實中類胡蘿卜素主要成分為β-胡蘿卜素，同時還富含β-隱黃質，花楸樹果實顯色程度主要與β-胡蘿卜素積累模式顯著正相關。

圖2 花楸樹（SP）與北京花楸（SD）果實3 個生長階段類胡蘿卜素成分比例Fig.2 Composition ratio of carotenoids in the sampled fruits of S.pohuashanensis（SP）andS.discolor (SD) at three developmental stages

表2 花楸樹（SP）與北京花楸（SD）類胡蘿卜素積累量時序及種間差異倍數統計表Table 2 Timing and species fold changes of carotenoid accumulation in fruits of S.pohuashanensis（SP）and S.discolor (SD)

2.2.2 北京花楸果實類胡蘿卜素積累量時序差異北京花楸果實中每一種顯色類胡蘿卜素的積累量（表1）和比例（圖2）均隨果實發育時序性顯著下降（表2），無色的八氫番茄紅素比例則逐漸升高。北京花楸果實發育3 個階段八氫番茄紅素積累量分別為1.34、2.32、1.52 mg·kg?1（表1），比例分別為20.26%、51.23%和56.74%；而顯色類胡蘿卜素積累量逐漸減少，比例從79.74%下降到43.26%，其中，葉黃素積累量分別為3.55、1.33、0.78 mg·kg?1，比例分別為53.62%、29.34%和29.22%，是北京花楸果實顯色類胡蘿卜素的主要成分；β-胡蘿卜素次之，積累量分別1.38、0.60、0.33 mg·kg?1，比例分別為20.81%、13.33%和12.22%。其它4 種顯色類胡蘿卜素積累量則較低。因此，北京花楸果實中類胡蘿卜素主要成分為葉黃素，而北京花楸果色褪綠后持續顯現為白色，可能與顯色類胡蘿卜素積累量時序性降低有關。

2.2.3 類胡蘿卜素積累量種間差異 花楸樹果實發育3 個階段類胡蘿卜素和顯色類胡蘿卜素積累量均高于北京花楸。隨著果實生長發育，花楸樹總類胡蘿卜素及顯色類胡蘿卜素積累量均逐漸增加，顯色類胡蘿卜素比例均較高；而北京花楸則相反，總類胡蘿卜素和顯色類胡蘿卜素積累量均逐漸減少，顯色類胡蘿卜素比例較低且逐漸降低。花楸樹果實發育3 個階段類胡蘿卜素總積累量分別為61.08、73.67、103.82 mg·kg?1，其中，顯色的類胡蘿卜素總積累量分別為57.75、68.42、97.93 mg·kg?1，比例分別為94.55%、92.87%和94.33%。北京花楸果實發育3 個階段類胡蘿卜素總積累量分別為6.61、4.52、2.68 mg·kg?1，其中，顯色的類胡蘿卜素總積累量分別為5.27、2.20、1.16 mg·kg?1，比例分別為79.73%、48.67%和43.28%。花楸樹果實發育3 個階段類胡蘿卜素及顯色類胡蘿卜素積累量分別是北京花楸的9、16、39 倍和11、30、83 倍。FC（表2）和t檢驗（表3）分析表明：果實發育3 個階段，花楸樹果實中的β-胡蘿卜素、β-隱黃質、葉黃素、玉米黃素、紫黃質以及無色的八氫番茄紅素積累量均分別顯著高于北京花楸。

表3 花楸樹（SP）與北京花楸（SD）類胡蘿卜素積累量時序及種間差異t 檢驗（P 值）統計表Table 3 T testing(P value) for timing and species differences of carotenoid accumulation in fruits of S.pohuashanensis（SP）and S.discolor (SD)

3 討論

花楸樹果實中類胡蘿卜素主要成分為β-胡蘿卜素，在與花楸樹親緣關系較近且果色相似的北歐花楸（S.aucuparia）中類胡蘿卜素主要成分也為β-胡蘿卜素[33-34]。花楸樹果實顯色程度與β-胡蘿卜素積累模式顯著正相關，而北京花楸果實中β-胡蘿卜素以及其他顯色類胡蘿卜素積累量顯著低于花楸樹，并隨北京花楸果實發育時序性下降。由此推測，花楸屬植物果實的著色程度主要與β-胡蘿卜素積累模式顯著正相關。該結果在Mikulic-Petkovsek等[35]和Zymone 等[36]研究中也得到了驗證，在花楸品種‘Konzentra’（橙色）、‘Alaja krupnaja’（亮橙色）和‘Fructo Lutea’（黃色）果實中含有大量的β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素物質，而在3 個北歐花楸與北京花楸的雜交品種‘Kirsten Pink’（粉色）、‘Red Tip’（局部淺紅）和‘White Swan’（白色）中類胡蘿卜素積累量均較低。

六氫番茄紅素和番茄紅素是類胡蘿卜素生物合成路徑上游主鏈物質[11,14]，γ-胡蘿卜素是β-胡蘿卜素底物[11,14]，但這些物質未被檢測到或僅在花楸樹或北京花楸果實發育某些階段檢測到少量積累，這可能與相關功能基因或調控因子表達量模式有關，因此，需從轉錄水平展開進一步研究。

除了類胡蘿卜素, 花楸樹和北京花楸及其他花楸屬植物果實中的植物色素還包含花青苷等類黃酮物質[35-36,41,46]，花楸屬植物果實果色形成可能同時受類胡蘿卜素和花青苷影響，因此，還應對花楸樹和北京花楸果實中花青苷積累模式展開分析，結合本研究結果，共同闡明花楸樹和北京花楸果色形成的關鍵植物色素物質。此外，類胡蘿卜素和花青苷等天然植物色素均屬代謝產物，是果實顏色表型的基礎和基因組下游的產物。目前，表型、代謝組、蛋白質組、轉錄組、基因組的多組學研究成為基礎科學研究的趨勢，并已應用于多種植物果色形成機理研究中[15-17,42]。因此，基于多組學的相關研究和聯合分析將更有助于揭示花楸屬植物果色形成機理。

4 結論

花楸樹果實中類胡蘿卜素種類和積累量均高于北京花楸。花楸樹果實中類胡蘿卜素主要成分為β-胡蘿卜素，其積累量隨果實發育時序顯著增加，花楸樹果實顯色程度與其積累量的增加顯著正相關；北京花楸果實中類胡蘿卜素積累量顯著低于花楸樹，并隨果實發育時序性下降，是其果實為白色而不顯其他顏色的主要原因之一。

致謝：

本項研究的試驗樣本采集得到張濤和孫佳偉的協助，在此表示感謝。