不同種源華重樓主要生物活性成分地理變異及其相關性分析

曾平生，厲月橋，周新華，姚甲寶，潘文婷，熊光康

(中國林業科學研究院亞熱帶林業實驗中心，江西 分宜 336600)

華重樓（Paris polyphylla var.chinensis(Franch.)）又名七葉一枝花，為百合科重樓屬植物，主要分布在我國長江以南江蘇、浙江、江西、福建、臺灣、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州和云南等省份[1]。華重樓為2015 年版《中國藥典》收載的重樓藥材的基原植物，以干燥根莖入藥，主要可用于消腫止痛、清熱解毒、定驚涼肝等藥用功能，可治療毒蛇咬傷、跌打傷痛、咽喉腫痛、驚風抽搐等病癥[2]。現代醫學藥理研究表明，華重樓化學成分包括甾體皂苷、蛻皮激素及其糖苷、黃酮等，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ等是其重要的生物活性成分和衡量藥材質量的重要指標[3]，具有抗腫瘤[4-6]、止血鎮痛、抗炎抑菌、調節免疫力[7]、促進骨細胞增殖分化等多方面功能[8]，為我國傳統常用中藥云南白藥、宮血寧膠囊等 80 余種中成藥的重要原料[9]。近年來，隨著對華重樓野生種質資源的無序開采，許多地區種質資源已瀕臨滅絕、種質遺傳多樣性銳減。開展華重樓天然種質收集、保存和評價工作，篩選生物活性成分高的優良種質，對華重樓種質資源保護和合理利用具有十分重要的意義[10]。

目前，國內外對于華重樓的研究集中在化學成分分析與藥理活性研究[11-13]、有效成分提取[14]、治療機制[15-16]和人工育苗、栽培方面[17-18]。而許多藥用植物的生物活性成分與原產地氣候生態因子密切相關，并在長期進化過程中形成特有的地理種源變異模式。因此研究重樓種質變異規律，優良種質篩選和人工栽培均具有重要意義。陳鐵柱等通過研究，證實了我國華重樓西部產區四川、重慶、云南等省7 種重樓皂苷甾體含量具有明顯差異，與氣候生態因子間亦存在密切關系[19]。但現有研究還未能從全分布區尺度反映華重樓主要生物活性成分的種源差異，并系統揭示華重樓根莖總皂苷、總酚酸、黃酮性狀指標的地理種源變異模式及其與原產地地理、氣候因子的相關關系，同時關于華重樓主要生物活性成分間的相關性分析方面的研究也相對較少。而對藥用植物開展種源評價、優良種質鑒定是種植基地選址和遺傳改良十分基礎的工作。

本研究在對我國華重樓天然分布區10 個種源種質收集的基礎上，開展了不同種源根莖器官總酚酸、黃酮、重樓總皂苷和皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的地理變異規律研究及主要生物活性成分間的相關性分析，旨在為華重樓遺傳改良和豐產栽培提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料的收集與處理

華重樓種源種質收集點選擇與地理氣候因子信息的收集。首先查閱我國華重樓天然分布范圍和分布地點相關資料基礎上，設置了河南、湖北、安徽、江西、廣東、廣西、重慶和湖南8 省份10 個地理種源收集地點，所采種源樣本基本覆蓋了華重樓在中國主要地理分布區。各種源所在的地理、生態氣候因子見表1。計算種源地與溫度相關的氣象因子時，以當地氣象臺站數據為依據，按海拔每上升100 m，溫度降低0.55℃進行修正[20]。

表1 華重樓種源采樣地理位置及主要氣象因子Table 1 Geographical locations and meteorological factors of the sampled provenances of Paris polyphyllavar. chinensis

華重樓種源種質的收集。于2018 年9 月—12 月，在每一種源選擇4—5 a 生，生長健康、發育完好的華重樓植株30 株以上，植株間距離40 m以上，采集根莖部作為種源樣品。樣品采回后，經中國林業科學研究院亞熱帶林業實驗中心植物分類專家王燕良高級工程師鑒定，均為華重樓植株。

1.2 樣品檢測與分析

1.2.1 總黃酮、總酚酸含量測定 先將華重樓根莖樣品分單株用清水洗凈，放入110℃烘箱殺青30 min，然后在45℃條件下烘干至恒質量。將烘干的樣品粉碎過100 目篩，作為待測樣品。

總黃酮的測定采用三氯化鋁法進行測定[21]。稱取粉碎樣品0.2 g，3 mL 95%乙醇，50℃水浴超聲處理30 min，收集至10 mL 容量瓶，重提3 次，合并上清液，冷卻至刻度，備用。取7 mL 上清液于25 mL 的比色管中，加入1.5% AlCl38 mL 和醋酸-醋酸鈉的緩沖液（PH 5.5）4 mL，并用50% 乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5 h，于415 nm下測試吸光度值。配置一系列濃度的標準溶液，按照上述樣品溶液的顯色方法同步顯色，于415 nm下測試吸光度值，以吸光度為縱坐標，顯色液中蘆丁的質量（mg）為橫坐標，作標準曲線，將得到的標準曲線方程計算樣品中總黃酮含量。

總酚酸含量采用高效液相色譜法測定[22]。對照品溶液的制備，取迷迭香酸對照品和丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL 含迷迭香酸7 μg、丹酚酸B60 μg 的混合溶液，即得。供試品溶液的制備 取供試品5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加水使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。測定時，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，測定。色譜條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長為25 cm，內徑為4.6 μm，粒徑為5 μm）；以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B；檢測波長為286 nm；柱溫為30℃；流速為每分鐘1.0 mL。

1.2.2 重樓皂苷含量測定 重樓皂苷含量采用高效液相色譜法測定[23]。對照品溶液的制備，取重樓皂苷I 對照品、重樓皂苷II 對照品、重樓皂苷VI 對照品及重樓皂苷VII 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 各含0.4 mg 的混合溶液，即得。供試品溶液的制備，取樣品粉末（過三號篩），稱取0.5 g 左右樣品，精密加入乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流30 min，待冷卻后再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，進樣。色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以水為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為203 nm，進樣量10 μL。以下為華重樓樣品皂苷的HPLC 色譜圖（圖1）。

1.3 數據分析

利用WPS EXCEL 軟件進行原始數據的整理、統計；利用SPSS 20. 0 軟件進行方差分析、多重比較、相關和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 華重樓根莖主要生物活性成分含量的種源差異

不同種源華重樓根莖主要生物活性成分含量比較（表2）。由表2 可以看出，不同種源華重樓根莖生物活性成分含量具有很大差異，總酚酸含量的變異范圍為1.718～5.436 mg·g?1，廣西桂林種源總酚酸含量最高，達5.436 mg·g?1，是總酚酸含量最低江西新余種源的3.16 倍。總黃酮含量的變異范圍為0.780～1.457 mg·g?1，含量最高的廣西桂林種源與含量最低的安徽祁門種源間相差了1.87 倍。不同種源總重樓皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）含量變異幅度為0.107～7.399 mg·g?1，其中江西豐城種源含量最高，河南新縣種源含量最低，前者是后者的69.149 倍。

圖1 華重樓4 種皂苷標準品的HPLC 色譜Fig.1 The HPLC chromatography of phloridzin and trilobatin in Paris polyphylla var.chinensis. sample

在華重樓根莖重樓皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ含量中，皂苷Ⅰ的變異范圍為0.008～2.106 mg·g?1，皂苷Ⅱ的變異范圍為0.000～0.646 mg·g?1，皂苷Ⅵ的變異范圍為0.000～0.521 mg·g?1，皂苷Ⅶ的變異范圍為0.00～9.170 mg·g?1。其中河南新縣種源未能檢出皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ號含量，廣西桂林種源未能檢出皂苷Ⅱ、Ⅵ含量。方差分析表明，不同種源華重樓根莖總酚酸、總黃酮、總皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）、皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和皂苷Ⅶ的含量均存在極顯著差異（P< 0.01）。

2.2 華重樓根莖主要活性成分含量與氣候生態因子相關性分析

對華重樓根莖主要活性成分含量與氣候生態因子間的相關性的顯著性檢驗表明，華重樓根莖總酚酸含量與海拔、總黃酮含量與全年日照時數、皂苷Ⅱ含量與1 月均溫間相關性顯著（P< 0.05），相關系數值分別為0.662、?0.708 和0.752。說明總酚酸含量與海拔、皂苷Ⅱ含量與1 月均溫間存在中度正相關關系，總黃酮含量與全年日照時數間存在中度負相關關系。總皂苷含量與海拔、皂苷Ⅱ與年均溫、皂苷Ⅵ含量與7 月均溫、皂苷Ⅶ含量與海拔的相關性極顯著（P< 0.01），其相關系數分別達到?0.840、0.877、0.821 和?0.766，表明總皂苷與海拔間呈高度負相關，皂苷Ⅱ與年均溫、皂苷Ⅵ與7 月均溫間存在高度正相關關系，皂苷Ⅶ含量與海拔存在中度正相關關系。總酚酸含量與東經和全年日照時數、總黃酮與東經、皂苷Ⅰ與東經相關系數較小且達未到顯著水平（P> 0.05）但存在較弱的負相關性，而總皂苷含量與年均溫和7 月均溫，皂苷Ⅶ含量與年均降雨量間存在一定的正相關性（表3）。

表2 不同種源華重樓主要生物活性成分含量差異Table 2 The difference of main medicinal active constituents contents of Paris polyphyllavar.chinensis from different provenances

2.3 華重樓根莖主要藥物活性成分含量相關分析

由表4 可以看出，華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量間相關性顯著，其相關系數分別為0.753、0.777 和0.637。說明華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、總黃酮與皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量呈中度正相關。總黃酮與皂苷Ⅰ含量和總皂苷與皂苷Ⅶ間的相關性達極顯著水平，總皂苷與皂苷Ⅶ的相關系數為0.941，說明總皂苷與皂苷Ⅶ含量呈高度正相關。其它指標間的相關性均未達到顯著性水平，但總酚酸含量與總皂苷、總酚酸與皂苷Ⅶ含量、總黃酮與皂苷Ⅶ含量相關系數均存在負相關性，皂苷Ⅰ與皂苷Ⅵ呈正相關性。

2.4 不同種源華重樓藥用成分含量聚類分析

以華重樓根莖總酚酸、黃酮和皂苷含量為特征指標，對10 個華重樓種源聚類分析結果（圖2）。從圖2 可以看出，以歐式距離15 為分界閾值，可將華重樓種源聚類為3 個類群，分別為低酚酸、低黃酮、高皂苷含量類群，高酚酸、高黃酮、低皂苷類群和中酚酸、中黃酮、中皂苷類群。其中安徽祁門種源屬低總酚酸、低黃酮和高皂苷含量類群，河南新縣、湖北宜昌和重慶石柱屬高酚酸、高黃酮、低皂苷類群，其余種源屬中酚酸、中黃酮、中皂苷類群。

表3 華重樓主要生物活性成分與產地氣候生態因子相關性分析Table 3 Correlation analysis of main medicinal active constituen and ecological factors of Paris polyphyllavar. chinensis

表4 華重樓根莖中主要生物活性成分的相關性分析Table 4 Analysis of correlation between main medicinal active constituent of Paris polyphyllavar.chinensis

圖2 不同種源華重樓總皂苷、黃酮和總皂苷含量聚類分析Fig.2 Cluster Analysis of phloridzin and trilobatin and total saponin contents in Paris polyphylla var.chinensis of different provenances

3 討論

重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等4 種活性成分含量是中藥材重樓質量的主要評價標準。本研究表明不同種源間華重樓根莖中總酚酸、總黃酮和重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ 4 個重樓皂苷及其總含量差異極顯著。從種源所處的地理位置來看，華重樓分布區北部種源重樓皂苷含量總體低于中南部種源含量。因此，今后在華重樓的中南部種源開展優良種質選擇或開展人工仿生栽培，將取得較好的效果。

本研究通過對華重樓根莖中總酚酸、總黃酮和重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ 4 個重樓皂苷及其總含量與其原產地氣候地理因子的相關分析表明，原產地海拔分布高的華重樓種源，具有較高的總酚酸含量，但其總皂苷含量和皂苷Ⅶ較低，年均溫和1 月均溫較高的種源根莖中皂苷Ⅱ含量相應較高，7 月均溫高的種源皂苷Ⅵ含量相應較高，而全年日照數高的種源總黃酮含量較低。因此，在海拔低、年均溫、1 月均溫和7 月均溫高的地區開展華重樓優良種質篩選工作，更易于獲得重樓總皂苷、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ含量高的優良種質，而在海拔高和全年日照時數少的地區更容易篩選到高總酚酸和總黃酮含量的優良種質。

華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、總黃酮與皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量呈中度正相關關系，總皂苷與皂苷Ⅶ含量呈高度正相關關系。這說明通過對這些具有相關性次生代謝物二者中一個指標的檢測，可以初步評估另外一個指標含量的高低。這種方法在野外樣品選優評價的初選階段，可以有效降低樣品檢測的工作量，提高評價效率。本研究中總酚酸與總黃酮，總黃酮與皂苷Ⅰ類別之間的顯著正相關性，可能與這些次生代謝物對原產地復雜生態環境因子響應具有高度相似性有關，此方面還有待于進行更深入的研究。

本研究證實了不同種源華重樓根莖主要生物活性成分含量存在極顯著差異，然而對華重樓生物活性成分形成地理種源差異的機制尚不明確，有待于在其全分布區進行多點種源試驗，解析其主要生物活性成分的形成機制。

4 結論

不同種源間華重樓根莖中總酚酸、總黃酮和重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ4 個重樓皂苷及其總含量差異極顯著。廣西桂林為總酚酸和總黃酮含量最高的種源，安徽祁門為總重樓皂苷含量最高的種源。華重樓根莖中總酚酸含量與原產地海拔、皂苷Ⅱ與1 月均溫呈中度正相關關系，總黃酮含量與全年日照時數、皂苷Ⅶ與海拔呈中度負相關關系。總皂苷與海拔間呈高度負相關關系，皂苷Ⅱ與年均溫、皂苷Ⅵ與7 月均溫間均呈高度正相關關系；華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、總黃酮與皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量呈中度正相關關系，總皂苷與皂苷Ⅶ含量呈高度正相關關系。通過聚類分可將華重樓種源劃分為三個類群，安徽祁門屬低酚酸、低黃酮、高皂苷類群；河南新縣、湖北宜昌和重慶石柱屬高酚酸、高黃酮、低皂苷類群；湖南張家界、江西豐城、江西分宜、廣西桂林、江西信豐和廣東連州屬中酚酸、中黃酮和中皂苷類群。