黃芪多糖聯合5-FU 對肝癌HepG2 細胞EMT轉化的影響

白 蕓 李永臻 祁艷娟 龍啟福?

(1.青海省人民醫院藥學部,西寧 810000;2.青海大學醫學院基礎醫學研究中心,西寧 810016;3.青海大學附屬醫院放射治療科,西寧 810000)

肝癌是由肝細胞或肝內膽管上皮細胞發生的惡性腫瘤[1]。目前,臨床上肝癌的治療存在預后差、轉移復發等因素使得近5 年肝癌患者的生存率仍然低于20%[2-3]。鑒于此,不同治療方式的協同治療將成為降低肝癌死亡率的重要舉措之一。近年來,中醫藥療法在惡性腫瘤的治療過程中被廣泛應用。研究發現,中醫藥在減少肝癌轉移復發、提高患者存活率方面發揮了一定的積極作用[4]。

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)通過干擾核酸的合成來抑制腫瘤細胞增殖,是具有細胞周期特異性的細胞毒類抗癌藥物[5],臨床使用非常廣泛,但是隨著化療進行,出現嚴重的副作用,例如胃腸道反應,骨髓抑制等[6]。大量研究表明[1,7-8],5-FU單獨用藥正在被與其它藥物的聯合作用所取代,這不僅可以降低藥物的副作用,而且還能降低腫瘤對藥物的耐藥性,相比于單獨用藥,聯合用藥具有更加廣闊的應用前景。黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是我國傳統中藥黃芪的主要活性成分之一,具有增強免疫,抗應激,抗炎,抗氧化等藥理作用[9],可協同增強多種化療藥物對腫瘤的治療效果[10-11]。研究表明,上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)指機體細胞由上皮表型向間質表型的轉變,其與腫瘤的發生、原位侵襲和遠處轉移密切相關[12]。因此,本研究擬就黃芪多糖聯合5-FU 對肝癌細胞株HepG2 EMT 的影響進行研究,以期為黃芪多糖和5-FU 在臨床的聯合應用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞株

人肝癌HepG2 細胞株購買自中國科學院典型培養物保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

5-氟尿嘧啶購自天津金耀氨基酸有限公司(批號:1803091);黃芪多糖凍干粉(純度96.81%)購自天津賽諾制藥有限公司(批號:Z20040086);胎牛血清(FBS)和青/鏈霉素購自HyClone 公司;MTT 粉劑、DMSO、DMEM 高糖細胞培養液、5×蛋白上樣緩沖液、BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司;RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自Beyotime公司;Transwell 小室、PVDF 膜、ECL 發光液購自Miliipore 公司;鼠抗人CXCR4 單克隆抗體、兔抗Ecadherin、vimentin 單克隆抗體、羊抗兔辣根過氧化物酶標記(HRP)的二抗均購自Abcam 公司;兔抗GAPDH 購自上海康成生物工程有限公司;Total RNA 提取試劑(RNAiso Plus)、cDNA 反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自TaKaRa 公司;熒光定量PCR 試劑盒[HieefTMqPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)]購自翊圣生物公司;實驗所用引物由日本TaKaRa 公司合成。

二氧化碳培養箱、超低溫冰箱、實時熒光定量PCR 購自美國Thermo 公司(型號:HERAcell 150i、DW-HL528、StepOne Plus);倒置顯微鏡購自Olympus 公司(型號:MF53);酶標儀購自美國Bio Rad 公司(型號:iMark);電泳儀、轉膜儀購自北京六一生物科技公司(型號:DYCZ-25D、DYCZ-40G);水浴鍋購自上海況勝有限公司(型號:HH-S1);高速冷凍離心機購自德國Eppendorf 公司(型號:5424R);搖床購自美國Scilogex 公司(型號:SKO180-E);化學發光成像儀購自北京賽智科技有限公司(型號:MiniChemi 610)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

人肝癌HepG2 細胞生長環境為DMEM 高糖培養液(含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素),細胞于37℃、5% CO2的培養箱中培養。采用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀況,當細胞數量占培養瓶底部70%～80%時用0.25%的胰酶消化傳代,常規每2～3 d 1 次。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 實驗分組

本研究旨在探討黃芪多糖聯合5-FU 對肝癌HepG2 細胞EMT 的影響,根據研究目的可分為五個實驗組,詳見表1。

1.3.3 MTT 測定藥物對HepG2 細胞生長的抑制效應

對數生長期的HepG2 細胞經胰酶消化后接種至96 孔板(100 μL 細胞懸液/孔,約2×104個細胞),于37℃、5% CO2培養箱過夜培養。待細胞貼壁后棄去原培養基,并用PBS 緩沖液清洗2 遍。在各孔中加入不同濃度藥物并做好標記,每組設置3個復孔于原培養環境下繼續培養。分別于24 h、48 h 時加入20 μL 12.07 mmol/L 的MTT 溶液,繼續培養4 h。棄盡上清液,每孔加入150 μL DMSO 溶液,37℃避光孵育10 min。使用酶標儀測定各孔細胞的吸光度OD 值,波長為490 nm,計算藥物對HepG2細胞生長抑制率=(1-處理組OD 均值/空白組OD均值)×100%。

1.3.4 Transwell 檢測HepG2 細胞侵襲能力

對數生長期的HepG2 細胞經胰酶消化后接種到6 孔板(100 μL 細胞懸液/孔,約2×104個細胞),常規培養,待細胞貼壁后在相應孔中加入所需藥物,每組設3 個復孔。24 h 后,將Matrigel 溶液加入到Transwell 小室以覆蓋聚碳酸酯膜,37℃干燥30 min。在Transwell 小室下層加入培養基(含10%FBS)作為趨化因子,小室上層孔中加入含1×105個細胞的無血清培養基。常規培養24 h 后用棉簽拭去未遷移細胞,無水乙醇固定20 min,結晶紫染色30 min,PBS 緩沖液沖洗2 次。高倍顯微鏡下統計穿膜細胞數。

1.3.5 實時熒光定量檢測HepG2 細胞EMT 相關基因的表達

對數生長期的HepG2 細胞經胰酶消化后接種至12 孔板,常規培養,待貼壁細胞數量占培養瓶底部90%時按分組給藥,每組設3 個復孔。常規培養24 h 后棄去培養基,收集細胞,按照RNAiso Plus(TRIzol)試劑說明書提取細胞總RNA,并利用分光光度儀測定樣品純度和濃度。以1 μg RNA 為模板,按照cDNA 反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。按照熒光定量PCR 試劑盒說明書檢測細胞中E-cadherin、vimentin mRNA、CXCR4 mRNA 的相對表達量。引物序列見表2。

1.3.6 Western blot 檢測HepG2 細胞EMT 相關蛋白的表達

對數生長期的HepG2 細胞經胰酶消化后接種至12 孔板,常規培養,待貼壁細胞數量占培養瓶底部90%時按分組給藥。常規培養24 h 后棄去上清,收集細胞,用RIPA 裂解液(含1 mmol/L PMSF)提取總蛋白,采用BCA 蛋白定量法測定所提蛋白的濃度。向待測樣品中加入5×上樣緩沖液煮沸10 min。上樣,10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白,400 mA 轉膜1.5 h。轉膜后將PVDF 膜置于5%脫脂牛奶中,室溫封閉1.5 h,按1 ∶1000 封閉液中加入E-cadherin、vimentin、CXCR4、GAPDH(內參)一抗于4℃孵育過夜,TBST 洗滌后加入二抗(1 ∶5000),并于室溫孵育1.5 h。ECL 試劑盒顯色,化學發光成像儀上顯影并采集圖片,用Image pro plus 軟件分析E-cadherin、vimentin、CXCR4 蛋白表達量。

表1 實驗的分組信息Table 1 Grouping information for the experiment

表2 EMT 相關基因實時熒光定量PCR 引物序列Table 2 Real time PCR primer sequence of EMT related genes

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件進行數據分析,數據資料以平均數±標準差()表示,多組間的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD 法,P≤0.05 為差異具有統計學意義。并用軟件Origin 9.0 對所得實驗數據進行作圖。

2 結果

2.1 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞的生長抑制效應

給藥后24 h,A 組(空白組)HepG2 細胞的生長抑制率為0,B 組(5-FU 組),C 組(黃芪多糖組),D組(392.63 μmol/L 黃芪多糖+23.90 μmol/L 5-FU)及E 組(785.26 μmol/L 黃芪多糖+23.90 μmol/L 5-FU)的生長抑制率分別是(11.56±2.18)%,(21.32±1.59)%,(39.75±1.85)%,(57.19 ±2.02)%,抑制率逐漸增高,且差異具有統計學意義,詳見表3;給藥48 h 后,從A 組到E 組的抑制率分別是:0%,(18.54 ± 2.13)%,(30.28 ± 1.8)%,(45.82 ±1.46)%,(63.97±1.75)%,抑制率逐漸增高,且差異具有統計學意義,詳見表3。從以上數據可以得出,與空白組相比,其余各組作用于HepG2 細胞時,對其生長均有抑制作用,且隨著藥物作用時間的延長抑制效應增強;黃芪多糖或5-FU 單獨處理組與聯合用藥組相比較,聯合用藥組的抑制效應顯著強于單獨處理組,且隨著黃芪多糖濃度的增加抑制作用增強。

2.2 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞侵襲能力的影響

Transwell 實驗結果顯示(圖1),HepG2 細胞經結晶紫染色后呈現紫色,形狀為不規則梭型,從A組(空白組)到E 組(785.26 μmol/L 黃芪多糖+23.90 μmol/L 5-FU),穿膜細胞的數量逐漸減少,說明細胞侵襲能力下降,具體穿膜數量詳見表4。與空白組相比,5-FU 組、黃芪多糖組及黃芪多糖聯合5-FU 組HepG2 細胞的侵襲能力顯著下降(P≤0.01);與5-FU 組相比較,黃芪多糖聯合5-FU 組HepG2 細胞的侵襲能力顯著下降(P≤0.01),且隨著黃芪多糖劑量的增加,侵襲能力逐漸下降。

表3 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞增殖的抑制作用()Table 3 Inhibitory effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on proliferation of HepG2 cells

表3 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞增殖的抑制作用()Table 3 Inhibitory effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on proliferation of HepG2 cells

注:與A 組相比較,?P≤0.05,??P≤0.01;與B 組相比,▲▲P≤0.01。Note.Compared with group A,?P ≤0.05,??P ≤0.01.Compared with group B,▲▲P ≤0.01.

表4 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞侵襲力的影響()Table 4 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the invasiveness of HepG2 cells

表4 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞侵襲力的影響()Table 4 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the invasiveness of HepG2 cells

2.3 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞EMT 相關基因mRNA 表達的影響

由圖2 可知,與空白對照組相比,黃芪多糖組、5-FU 組和黃芪多糖聯合5-FU 組HepG2 細胞E-cadherin mRNA 表達量增加、vimentin mRNA 和CXCR4 mRNA表達量下降,差異均具有統計學意義(P≤0.05;P≤0.01);與5-FU 組相比較,聯合作用組HepG2 細胞Ecadherin mRNA 表達量均增加、vimentin mRNA 和CXCR4 mRNA 表達量均下降(P≤0.05;P≤0.01)。

2.4 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞EMT 相關蛋白表達的影響

由圖3 和表5 可知,與空白對照組相比,黃芪多糖組、5-FU 組和黃芪多糖聯合5-FU 組HepG2 細胞E-cadherin 蛋白表達量上調、vimentin 蛋白、CXCR4 蛋白表達量下降,差異具有統計學意義(P≤0.01);與5-FU 組相比較,聯合組HepG2 細胞E-cadherin 蛋白表達量均增加、vimentin 蛋白和CXCR4 蛋白表達量均下降,差異具有統計學意義(P≤0.05;P≤0.01)。

圖1 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞侵襲力的影響Note.Compared with group A,??P ≤0.01.Compared with group B,##P ≤0.01.Figure 1 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the invasiveness of HepG2 cells

表5 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞EMT 相關蛋白表達的影響Table 5 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the expression of EMT-related proteins in HepG2 cells

圖2 黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞EMT 相關基因mRNA 表達的影響Note.Compared with group A,?P <0.05,??P <0.01.Compared with group B,#P <0.05,##P <0.01.Figure 2 Effect of Astragalus polysaccharide combined with 5-FU on mRNA expression of EMT-related genes in HepG2 cells

3 討論

肝癌治療難度大,預后差,一直是臨床上面臨的重大難題和挑戰,其主要因素是肝癌細胞的侵襲和轉移能力,而EMT 是癌細胞獲取遷移和侵襲能力的重要機制[12]。臨床上對癌癥患者進行放化療治療時,會不同程度的影響其免疫系統,且隨著腫瘤耐藥及藥物敏感性降低等情況的出現,臨床上常出現治療失敗的情況,因此采用中藥及其活性成分與化療藥物聯合使用,以達到調節免疫力進而增敏增效和減毒的作用。黃芪多糖是黃芪中最重要的天然活性成分,毒性較小,可以具有抗腫瘤的作用[13]。因此,在本研究中,我們采用HepG2 細胞體外培養的方法,研究了黃芪多糖聯合5-FU 對HepG2 細胞EMT 轉化影響,研究結果顯示黃芪多糖和5-FU 聯用時,可明顯抑制HepG2 細胞的生長,抑制效應具有劑量和時間依賴性,進一步研究發現,黃芪多糖和5-FU 聯用可以顯著降低肝癌細胞的侵襲能力,且隨著黃芪多糖濃度的增加侵襲能力越弱。

中藥黃芪的藥用歷史在我國已經有兩千多年,是中醫補氣的常用藥,主要藥效成分黃芪多糖,是一種良好的免疫調節劑[14],可以促進樹突狀細胞成熟增強機體的免疫功能參與抗腫瘤的作用,研究顯示,其在體外可以抑制人胃癌細胞株的增殖,并能誘發人胃癌細胞凋亡的作用[15]。魏佳等[16]研究顯示黃芪多糖與吉非替尼聯用促進肺腺癌細胞中Ecadherin 表達水平降低,Vimentin 表達水平升高,抑制EMT 的進程,顯著抑制癌細胞的增殖。Ecadherin 和Vimentin 在EMT 過程中發揮著重要作用,E-cadherin 表達減少或缺失是腫瘤轉移和侵襲的促進因子之一[17],而抑制Vimentin 的完整性可抑制間充質細胞遷移[18]。邱艷麗等[19]研究發現,黃芪多糖對子宮內膜癌組織中E-cadherin 基因和蛋白的表達具有促進作用,對β-catenin 基因和蛋白的表達具有抑制作用,表明黃芪多糖可以通過調節EMT相關蛋白為發揮抗腫瘤作用。汪一帆等[20]研究顯示抑肺飲(黨參、黃芪、川芎、蜈蚣等)聯合順鉑對肺癌移植瘤生長和Vimentin 蛋白表達具有明顯抑制作用,并且可上調E-cadherin 的表達,這表明抑肺飲的作用機制可能與腫瘤細胞EMT 相關。本研究結果顯示,黃芪多糖聯合5-FU 可顯著增加HepG2 細胞中E-cadherin mRNA 和蛋白的表達,顯著降低HepG2 細胞中vimentin mRNA 和蛋白的表達,而且,兩種藥物的聯合效果也顯著優于各自單獨使用時的效果,說明黃芪多糖可以通過調節肝癌細胞HepG2 的EMT 進程增強5-FU 的治療效果。

CXCR4 可以通過SDF-1/CXCR4 生物軸,調控腫瘤細胞的EMT 過程,進而增強腫瘤細胞增殖和侵襲等行為[21]。研究顯示,在肝癌、肺癌、乳腺癌等細胞中CXCR4 均存在高表達,而在正常組織中低表達或者不表達[20,22-23]。Kaemmerer 等[24]研究發現CXCR4 在肝癌中的表達率約50%,這種高表達預示著不良預后。CXCR4 還參與了機體免疫應答及腫瘤耐藥性[25],因此,CXCR4 可能作為一個疾病進展的標志物。本研究中顯示,黃芪多糖聯合5-FU 可顯著降低HepG2 細胞中CXCR4 mRNA 和蛋白的表達,與單使用5-FU 治療組相比,黃芪多糖聯合5-FU組效果更為顯著,說明黃芪多糖增強了細胞對5-FU的敏感性,從而有效起到抑制肝癌細胞HepG2 增殖和侵襲的行為。

綜上所述,黃芪多糖可以增強5-FU 抗腫瘤作用;黃芪多糖和5-FU 聯合使用可抑制肝癌細胞的轉移作用,可能與抑制肝癌EMT 有關。這為黃芪多糖對肝癌臨床輔助治療提供了重要支持。