西維來司鈉對COPD 大鼠GRP78/PERK/CHOP信號通路及氣道高分泌的影響

王生成 李 琪 蔡瀟陽 唐詠婕

(1.儋州市人民醫院呼吸內科,海南儋州 571700;2.海南醫學院第一附屬醫院呼吸內科,海口 570102)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種臨床常見呼吸系統疾病,好發于老年人,隨著我國老齡化人口加劇,COPD 發病率呈逐漸增加趨勢,嚴重威脅老年人的身體健康及生活質量,并給家庭及社會帶來嚴重經濟負擔[1-2]。西維來司鈉(sivelestat sodium)又名ONO-5046,是一種小分子中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)抑制劑,可選擇性抑制彈性蛋白酶,抑制肺泡上皮炎性因子釋放及黏液分泌,減輕肺損傷[3-4]。氣道黏液高分泌是COPD 主要病理生理特征,是影響疾病進展及預后的獨立危險因素,其在COPD 發病中的作用成為近來研究熱點之一[5]。葡萄糖調節蛋白(glucose-regulated protein,GRP)78/蛋白激酶R 樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/CCAAT

增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)信號通路是內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導的細胞凋亡一種重要途徑,ERS 與COPD 肺上皮細胞凋亡、氣道黏液分泌密切相關[6-7]。但西維來司鈉減輕COPD 氣道黏液高分泌是否與GRP78/PERK/CHOP 信號通路有關尚未見相關報道。本研究通過建立COPD 大鼠模型,擬初步探究不同濃度西維來司鈉對COPD 大鼠氣道高分泌及GRP78/PERK/CHOP 信號通路的影響,以期揭示其作用機制,為尋找COPD 氣道黏液高分泌的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級6 周齡雄性SD 大鼠60 只,體重210～230 g,購自南京君科生物工程有限公司[SCXK(蘇)2017-0005],動物飼養在南京君科生物工程有限公司[SYXK(蘇)2017-0033]。本研究符合動物倫理學3R 原則,實驗經過儋州市人民醫院倫理委員會批準(IACUC20180901-02)。

1.2 主要試劑與儀器

西維來司鈉(批號:S7198,純度≥98%)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(批號:L2630)均購自美國Sigma-Aldrich 公司。

南京香煙(每支焦油含量8 mg、煙堿量0.8 mg、一氧化碳量7 mg)購自江蘇中煙南京卷煙廠;RNA提取試劑盒(批號:R0011)購自上海碧云天有限公司;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒(批號:6210A)、TB Green?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)實時熒光定量PCR 試劑盒(批號:RR820A)均購自日本TaKaRa 公司;黏蛋白5AC(MUC5AC)單克隆抗體(批號:ab24071)、葡萄糖調節蛋白78(GRP78) 單克隆抗體(批號:ab21685)、蛋白激酶R 樣內質網激酶(PERK)單克隆抗體(批號:ab79483)、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)單克隆抗體(批號:ab179823)、GAPDH 單克隆抗體(批號:ab9485)、羊抗鼠IgG 二抗(批號:ab205719)均購自英國Abcam 公司。

動物肺功能儀(型號:PONYFX)購自意大利科時邁公司;光學顯微鏡(型號:DM3000)購自德國徠卡公司;熒光定量PCR 儀(型號:7500)購自美國Thermo Fisher 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD 模型制備

根據參考文獻[7]并結合預實驗改良情況建立COPD 大鼠模型。自制50 cm×50 cm×30 cm 動物煙熏箱,每次放入12 只大鼠,于造模第2～7 天、9 d～14 d,點燃香煙使大鼠被動吸煙,每天1 次,每次12支(煙霧濃度1.41×103mg/cm3,CO 濃度1.12×103mg/cm3,氧濃度21%),每次30 min,煙熏區側壁鉆孔適當通風,以防大鼠CO 中毒。并分別于第1、8、15、21 天氣管滴注LPS 200 μg(1 mg/mL)。刺激1周期后20 d 成模。

1.3.2 實驗分組及給藥

成模大鼠按照隨機數字表法分為COPD 組及西維來司鈉干預組(低、中、高劑量),另取正常飼養大鼠為對照組(NC 組),每組12 只。西維來司鈉低、中、高劑量組分別于成模后第1 天起尾靜脈注射西維來司鈉2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg[8-9],NC 組、COPD 組注射等量生理鹽水,每天2 次,連續干預21 d。

1.3.3 標本采集

干預結束后,腹腔注射麻醉處死大鼠,打開胸腔,暴露雙肺,取出右肺,暴露氣管,在氣管下段作小T 型切口,插入鈍鋼針頭,手術線固定,注射器注入8 mL 生理鹽水,反復抽吸3 次回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),重復3 次,收集BALF 約8 mL,于3000 r/min,有效離心半徑10 cm 離心10 min,留取上清分裝,置-80℃冰箱中保存備用。另取部分右肺組織分別于4%多聚甲醛固定及液氮中保存備用。

1.3.4 肺功能指標檢測

干預結束后,麻醉各組大鼠并進行固定,切開頸部皮膚,分離皮下組織,在氣管肋骨間切口并插入接有三通的氣管插管,縫合固定氣管切口后將氣管插管另一端介入動物肺功能儀,檢測各組大鼠0.1 s 用力呼氣量(0.1 s forced expiratory volume,FEV0.1)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)水平。

1.3.5 肺組織病理學變化檢測

于4%多聚甲醛固定的右肺組織進行石蠟包埋后,以4 μm 厚度連續切片,進行蘇木素-伊紅染色(HE 染色),于光鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.3.6 大鼠肺泡上皮細胞凋亡檢測

取大鼠肺組織石蠟切片,采用原位末端標記法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)檢測各組大鼠肺上皮細胞凋亡情況,具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行,隨機選取5 個視野,于400 倍光鏡下計數肺泡上皮細胞中凋亡細胞數取平均值。凋亡率=凋亡肺泡上皮細胞數/肺泡上皮總數×100%。

1.3.7 肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平檢測

采用RNA 提取試劑盒提取肺組織總RNA,用紫外分光光度計檢測總RNA 濃度及純度(OD280/OD260:1.8～2.0)。反轉錄得到cDNA,置于-20℃保存備用。采用實時熒光定量 PCR (Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)儀對肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 片段進行擴增。引物由上海碧云天有限公司合成,引物序列見表1。采用20 μL 反應體系:TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O 6 μL。反應條件:95℃30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40 個循環。采用2-ΔΔCT法對肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 相對表達水平進行定量分析。GAPDH 為內參基因。

1.3.8 肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達量檢測

采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達。提取肺組織總蛋白,BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。取50 μg 蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜至聚偏氟丙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,分別滴加一抗MUC5AC(稀釋比1 ∶2000)、GRP78(稀釋比1 ∶1000)、PERK(稀釋比1∶1000)、CHOP(稀釋比1 ∶1000)、GAPDH(稀釋比1∶5000),4℃過夜,PBS 洗滌后添加羊抗鼠IgG 二抗(稀釋比1 ∶10000),室溫下封閉2 h,PBS 洗滌后使用化學發光增強法(ECL)發光試劑盒顯影,分析各蛋白條帶灰度值,以β-actin 為內參計算目的蛋白條帶的相對比值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。實驗數據以平均數±標準差()表示,多組數據比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺功能指標比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠FEV0.1、FVC 水平顯著降低(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠FEV0.1、FVC 水平依次升高(P<0.05),見表2。

2.2 各組大鼠肺組織病理學變化情況

NC 組大鼠肺泡組織結構完整,無明顯病理改變。COPD 組大鼠肺組織支氣管壁增高,肺泡組織壁變薄,纖毛脫落、倒伏明顯,有大量炎性細胞浸潤。西維來司鈉各干預組大鼠肺組織病理改變均減輕,見圖1。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 RT-qPCR primer

表2 各組大鼠肺功能指標FEV0.1、FVC 水平比較(mL,n=12,)Table 2 Comparison of pulmonary function indexes FEV0.1 and FVC levels in each group

表2 各組大鼠肺功能指標FEV0.1、FVC 水平比較(mL,n=12,)Table 2 Comparison of pulmonary function indexes FEV0.1 and FVC levels in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

2.3 各組大鼠肺泡上皮細胞凋亡率比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠肺泡上皮細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠肺泡上皮細胞凋亡率依次降低(P<0.05),見表3。

圖1 各組大鼠肺組織病理學變化(HE 染色)Figure 1 Pathological changes of lung tissue in each group(HE staining)

表3 各組大鼠肺泡上皮細胞凋亡率比較(n=12,)Table 3 Comparison of apoptosis rate of alveolar epithelial cells in each group

表3 各組大鼠肺泡上皮細胞凋亡率比較(n=12,)Table 3 Comparison of apoptosis rate of alveolar epithelial cells in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

2.4 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 水平顯著增加(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平依次降低(P<0.05),見表4。

2.5 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達量比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白量顯著增加(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達量依次降低(P<0.05),見表5、圖2。

表4 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平比較(n=12,)Table 4 Comparison of expression levels of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP mRNA in lung tissues of rats in each group

表4 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平比較(n=12,)Table 4 Comparison of expression levels of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP mRNA in lung tissues of rats in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

表5 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達量比較(n=12,)Table 5 Comparison of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP protein expression in lung tissue of rats in each group

表5 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達量比較(n=12,)Table 5 Comparison of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP protein expression in lung tissue of rats in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

圖2 Western blot 檢測大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達Note.A,NC group.B,COPD group.C,Sivelestat sodium low dose group.D,Sivelestat sodium middle dose group.E,Sivelestat sodium high dose group.Figure 2 Western blot detection of MUC5AC,GRP78,PERK,CHOP protein expression in rat lung

3 討論

COPD 是一種常見的以持續氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病,氣流受限進行性發展,與氣道和肺臟對有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關,其中煙草是COPD 重要致病原因,LPS 是一種細菌內毒素,二者聯合刺激大鼠氣道黏膜可激活多種炎癥、應激信號通路,與氣道黏液高分泌調控密切相關[10-12]。因此本研究采用煙熏結合LPS 刺激建立COPD 大鼠模型,結果發現,與NC 組比較,COPD 組大鼠肺組織支氣管壁增高,肺泡組織壁變薄,纖毛脫落、倒伏明顯,有大量炎性細胞浸潤,FEV0.1、FVC 水平顯著降低,符合COPD 典型臨床特征,提示COPD 大鼠模型制備成功,可用于后續實驗。

正常氣道黏膜表面覆蓋少量黏液,可保護氣道、潤滑上皮、防御外來刺激物和細菌等。氣道黏液由杯狀細胞、黏膜下腺體細胞及氣道上皮細胞分泌,氣道黏蛋白(mucoprotein,MUC)是氣道黏液高分泌大分子的主要組成成分,是產生氣道彈性與黏性的主要原因,其中MUC5AC 是支氣管上皮產生的主要呼吸道MUC,在病理情況下可顯著增加,其表達水平可代表氣道黏液分泌強度[13-14]。西維來司鈉是一種NE 抑制劑,可競爭性抑制中性粒細胞活化及浸潤,減少自由基產生及釋放,發揮抗炎、抗氧化等作用。本研究結果發現,與NC 組比較,COPD組大鼠肺組織MUC5AC mRNA 及蛋白量顯著增加,提示COPD 大鼠存在氣道黏液高分泌。而西維來司鈉可呈劑量依賴性減輕大鼠肺組織病理學改變、改善肺功能及抑制MUC5AC mRNA 及蛋白表達,提示西維來司鈉可能對COPD 大鼠氣道黏液高分泌癥狀具有一定緩解及治療作用,可能與抑制COPD 早期炎癥反應有關[15-16]。

內質網廣泛存在于真核細胞中,是蛋白質合成、折疊及Ca2+儲存的主要場所。在毒物或氧化應激刺激等調解下,內質網內出現未折疊或錯誤折疊蛋白的積累和Ca2+平衡失衡,導致ERS[17]。適度ERS 有助于通過未折疊蛋白反應(protein response,UPR)促進蛋白質加工的恢復,而嚴重和持續的ERS可觸發相關細胞的凋亡。GRP78/PERK/CHOP 信號通路是ERS 介導的一種重要細胞凋亡通路,ERS發生時,GRP78 表達升高,PERK 發生磷酸化,進而CHOP 表達增多,CHOP 蛋白是ERS 介導細胞凋亡程度的標志蛋白[18]。本研究結果發現,與NC 組比較,COPD 大鼠肺泡上皮細胞凋亡率、肺組織GRP78、PERK、CHOP mRNA 及蛋白量顯著增加,而西維來司鈉可呈劑量依賴性降低COPD 大鼠肺泡上皮細胞凋亡率、肺組織GRP78、PERK、CHOP mRNA及蛋白表達,可能因為氣道上皮細胞在維系上皮結構完整性及功能中發揮重要作用,氣道上皮損傷、凋亡和黏液高分泌會加重氣道損害,促進疾病進展,提示西維來司鈉可減輕氣道黏液高分泌,可能與抑制GRP78/PERK/CHOP 信號通路激活,抑制COPD 肺組織上皮細胞凋亡有關[19-20]。

綜上所述,西維來司鈉可減輕COPD 大鼠氣道黏液高分泌,可能與抑制GRP78/PERK/CHOP 信號通路激活,抑制COPD 肺組織上皮細胞凋亡有關。但關于西維來司鈉減輕COPD 氣道黏液高分泌機制是否還涉及其他炎癥相關等通路共同參與,有待進一步深入探究。