基于NLRP3/caspase-1 研究電針刺激對腦卒中大鼠小膠質細胞形態轉換及神經元凋亡的影響

鄧寒冰 李春琴 張 粲 金祖敏

(1.海口市第三人民醫院針灸理療科,海口 571100;2.海南醫學院附屬第二醫院針灸科,海口 571100;3.云南中醫藥大學推拿基礎教研室,昆明 650500;4.貴州織金縣中醫院治未病科,貴州畢節 552100)

腦卒中屬臨床常見心腦血管疾病,致殘率、復發率、致死率均較高[1],修復神經元、緩解小膠質細胞形態等可改善腦卒中[2]。電針刺激可緩解神經疼痛、促進受損神經功能[3],但具體機制尚未清楚。激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor protein 3,NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(ccysteine aspartate proteolytic enzyme 1,caspase-1)通路可在組織損傷、器官功能障礙中發揮作用[4],抑制NLRP3/caspase-1 通路在小膠質細胞中可減緩炎癥反應,從而緩解脊髓損傷處后肢運動功能[5],但尚未發現腦卒中中相關研究。本研究采用Longa 線栓法改良建立腦卒中大鼠模型,探究三種不同電針方法對腦卒中大鼠小膠質細胞、神經元的影響,觀察是否均有影響,以期為臨床上緩解腦卒中提供一定理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只清潔級健康SD 大鼠、6～7 周齡,雌雄不限,購自河南省實驗動物中心[SCXK(豫)2017-0001],飼養于海南省藥品檢驗所[SYXK(瓊)2016-0009]。體重(200±20)g,所有大鼠均在溫度(25±1)℃、濕度(55±5)%、12 h/12 h(黑暗/光照)在實驗動物中心常規飼養。本實驗經本院倫理協會審核并通過(20170018),并按3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

尼氏染色液(北京索萊寶科技有限公司,批號:20180118);Tunel 細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)(碧云天科技有限公司,批號:20170209);一抗Iba1(羊抗鼠)、ED-1(兔抗鼠)、NLRP3(兔抗鼠)、caspase-1(兔抗鼠)、pro-caspase-1(兔抗鼠)、內參GADPH(兔抗鼠)、二抗羊抗兔、Alaxa Fluor? 555抗羊熒光二抗、Alexa Fluor? 594 抗兔熒光二抗(英國abcam,批號:20180415、20170519、20160114、20180408、20180408、20160112、20170803、20180418、20160111);電針儀(四川科儀誠科技有限公司,型號:6805-D);蛋白凝膠成像儀(上海天能公司,型號:Tanon 3500/3500R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物建立腦卒中模型

48 只大鼠據參考文獻[6]按照Longa 線栓法改良建立大鼠腦卒中模型,3% 戊巴比妥鈉(0.5 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,大鼠右側側臥于手術臺上,去左頸部鼠毛并用醫用乙醇消毒,切開皮膚分離出左側頸總動脈、頸外動脈并結扎。參考文獻[7]分離頸內動脈,在頸內動脈與頸外動脈分叉膨大處切口,尼龍線插入頸內動脈切口端,長度20 mm,插線結束后尼龍線與頸內動脈結扎。傷口處和皮膚逐層縫合,并注射青霉素防止感染。術后2 h Longa 驗證模型成功與否,其中1～3 分為建模成功,模型成功率100%。模型組大鼠隨機分為4 組,模型組、陽陵泉+配穴組、關元組、照海+申脈組,每組12只;12 只健康大鼠不結扎、不切口不插線,其余步驟相同,對照稱為假手術組。

1.3.2 電針刺激模型動物

大鼠建模3 d 陽陵泉+配穴組、關元組、照海+申脈組,參考《實驗針灸學》[8]對實驗動物陽陵泉+配穴、關元、照海+申脈針灸穴位處取穴電針刺激,將針灸針分別連接電針儀,電壓2～4 V,頻率2/100 Hz、脈沖寬度0.5 ms、疏波4 Hz,逐漸加大強度直至大鼠出現輕微顫抖為度,留針30 min,每天一次,7 d為一個療程,連續進行兩個療程。模型組、假手術組不進行任何處理,飼養相同天數。

1.3.3 Longa 評分評價電針對腦卒中大鼠行為學的影響

Longa 評分法[6]評價大鼠模型成功和電刺激后評價大鼠神經損傷程度。

1.3.4 電針對腦卒中大鼠小膠質細胞的影響

實驗結束后麻醉大鼠,每組隨機取6 只,迅速處死大鼠,取全腦組織,4%多聚甲醛灌注固定,取腦組織損傷處切片(5 μm),免疫熒光染色小膠質細胞,Iba1(1 ∶500)和ED-1(1 ∶200)混合(1 ∶1)稀釋,4℃過夜,添加抗羊(1 ∶1000)、抗兔(1 ∶200)熒光二抗混合液,室溫孵育2 h,PBS 清洗,抗熒光猝滅液(含DAPI)封片后熒光顯微鏡下觀察,其中Iba1 染色紅色,代表小膠質細胞;ED-1 染色綠色,代表被激活的小膠質細胞。

1.3.5 電針對腦卒中大鼠神經元形態的影響

取1.3.4 中切片,尼氏染色觀察神經元形態,石蠟切片梯度乙醇復染、二甲苯脫蠟、梯度乙醇浸潤,切片進入A 液(cresyl violet stain)中56℃染色60 min,PBS 漂洗,置于B 液(Nissl differentiation)分色數秒至2 min 直至背景色接近無色,晾干,無水乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片,顯微鏡下觀察神經元形態、尼氏小體情況。

1.3.6 Tunel 染色觀察電針對腦卒中大鼠神經元凋亡的影響

取1.3.4 中切片脫蠟處理,滴加2%蛋白酶K室溫孵育20 min,PBS 清洗后滴加50 μL Tunel 反應混合溶液,濕盒孵育60 min,抗熒光猝滅液(含DAPI)封片后熒光顯微鏡下觀察,其中綠色熒光顯示凋亡陽性細胞數量。

1.3.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測觀察電針對腦卒中大鼠NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白的影響

其余大鼠麻醉后迅速處死,模型組部分取腦卒中組織,假手術組取腦組織相同部位,蛋白提取試劑盒提取總蛋白,每孔上樣20 μL 測定樣本中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平,一抗NLRP3(1/100000)、pro-caspase-1(1/2000)、caspase-1(1/100000)、GADPH(1/5000),4℃孵育過夜;加入對應二抗,室溫孵育1 h。DAB 顯色試劑盒顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統計學方法

統計學軟件SPSS 25.0 進行數據分析,計量數據以平均數±標準差()描述,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法檢驗。當P<0.05 時,差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對腦卒中大鼠行為學影響

與假手術組比較,模型組Longa 評分升高(P<0.05)。與模型組相比,陽陵泉+配穴組、關元組、照海+申脈組Longa 評分降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 電針對腦卒中大鼠Longa 評分的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 1 Effect of electroacupuncture on Longa score of stroke rats

2.2 電針對腦卒中大鼠小膠質細胞的影響

假手術組小膠質細胞呈現“雙極或單極”狀態,伴隨細長突起,細胞形狀類似。模型組小膠質細胞突起明顯增多,Iba1/ED-1 顯著高于假手術組(P<0.05)。電針刺激后,陽陵泉+配穴組、關元組、照海+申脈組較模型組小膠質細胞形態逐漸恢復,突起逐漸恢復,Iba1/ED-1 顯著低于模型組(P<0.05)。見圖2。

2.3 電針對腦卒中大鼠神經元形態的影響

假手術組神經元形態規則,結構完整,細胞內可見豐富的尼氏小體。模型組神經元出現明顯皺紋,形狀不規則、染色較淺,尼氏小體數量顯著少于假手術組(P<0.05)。電針刺激后,陽陵泉+配穴組、關元組、照海+申脈組較模型組神經形態有所改善,神經元形態較飽滿,尼氏小體數量顯著多于模型組(P<0.05)。見圖3。

圖2 電針對對腦卒中大鼠小膠質細胞Iba1/ED-1 的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Arrows indicated prominent parts.Asterisks indicated normal nerve cells.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 2 Effect of electroacupuncture on Iba1/ED-1 of microglia in rats with stroke

2.4 電針對腦卒中大鼠腦組織NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平的影響

與假手術組相比,模型組腦組織中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平升高(P<0.05)。電針刺激后,與模型組相比,陽陵泉+配穴組、關元組、照海+申脈組腦組織中NLRP3、caspase-1、procaspase-1 蛋白水平降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 電針對腦卒中大鼠神經元凋亡的影響

與假手術組相比,模型組Tunel 陽性細胞數升高(P<0.05)。電針刺激后,與模型組相比,陽陵泉+配穴組、關元組、照海+申脈組Tunel 陽性細胞數降低(P<0.05)。見圖5。

圖3 電針對腦卒中大鼠神經元形態的影響(尼氏染色)Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 3 Effect of electroacupuncture on neuron morphology in stroke rats (Nissl staining)

圖4 電針對腦卒中大鼠腦組織NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 4 Effect of electroacupuncture on the levels of NLRP3,caspase-1 and pro-caspase-1 protein in brain tissue of stroke rats

圖5 電針對腦卒中大鼠神經元凋亡的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Green,Tunel positive cell number.Blue,DAPI(Tunel staining).Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 5 Effect of electroacupuncture on neuron apoptosis in stroke rats

3 討論

腦卒中可激活小膠質細胞,加快神經毒素的產生;可快速改變神經元活動和突觸功能,改變本身作用,產生神經毒素和改變神經元功能均加重疾病[9-10],因此緩解小膠質細胞狀態、減緩神經元凋亡可能緩解疾病。本文以Longa 線栓法改良建立缺血性腦卒中模型,研究發現建模后小膠質細胞細胞突起增多,Iba1/ED-1 升高;神經元出現形狀不規則、明顯皺紋、尼氏染色較淺現象,尼氏小體數量減少、Tunel 陽性細胞數升高,而尼氏小體正常情況下能被堿性染料染成藍紫色,當神經元受到刺激時,尼氏小體數量減少,可反映神經元受刺激程度;Tunel陽性細胞數反映神經元凋亡數量,細胞數越多凋亡越嚴重。提示腦卒中模型中小膠質細胞被激活、突起改變,神經元刺激嚴重,出現凋亡現象,小膠質細胞原本結構破壞、神經元出現凋亡。

腦卒中中醫屬“中風”范疇,東漢張仲景提出“絡脈空虛”,氣血兩虛、淤血阻絡是病機之本,養陰益氣、活血化瘀是治療方案[11]。祖國醫學認為,針灸是一種刺激,作用于腧穴,疏通經絡、清淤散結、驅散陰寒,達回陽救逆、強身健體、預防疾病之功效[12]。本研究采用三種不同針刺方法探究對對腦卒中大鼠的影響,發現陽陵泉聯合配穴、關元、照海聯合申脈均可改善小膠質細胞形態和神經形態,同時使神經元由激活狀態轉化為正常狀態,緩解神經元凋亡,從而改善腦卒中病情。

NLRP3 炎癥小體被激活可直接與效應分子pro-caspase-1 結合形成炎癥小體和成熟的caspase1,其中caspase1 可影響小膠質細胞和細胞凋亡從而影響疾病進程[13];激活caspase1 蛋白可引發細胞凋亡,嚴重時導致細胞死亡,加快急性和慢性腦部疾病發生發展[14]。本研究發現,與假手術組相比,模型組腦組織中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平升高,提示腦卒中腦組織中NLRP3/caspase1 處于激活狀態,可進一步激活小膠質細胞,從而改變小膠質細胞突觸功能、促進神經元凋亡,影響疾病進程。而電針刺激后腦組織中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平降低,可能電針刺激抑制NLRP3/caspase1 通路的激活,進而減弱通路對小膠質細胞和神經元的作用,從而減緩疾病。

綜上所述,電針分別刺激腦卒中大鼠陽陵泉+配穴、關元、照海+申脈處,均可使小膠質細胞突起減少、形態逆轉,神經元形態緩解、凋亡降低,可能是抑制NLRP3/caspase-1 通路實現的。但電針作用腦卒中大鼠機制復雜,也可能影響其他通路從而影響小膠質細胞、神經元,需在以后研究中進一步發現其機制,更加深入探討其關系。