一種SD 大鼠高血脂模型建立方法的驗證以及造模時長對相關指標的影響探討

蔡 拓 張 慈 易吉平 余曉巍?

(1.湖南省職業病防治院,長沙 410007;2.中南大學湘雅護理學院,長沙 410013)

高脂血癥又稱為血脂異常或脂代謝紊亂,是引起心腦血管疾病的重要危險因素之一。其中以低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)增高、血清總膽固醇(total cholesterol,TC)增高、甘油三酯(triglyceride,TG)增高或高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)降低為特點的血脂異常是動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)重要的危險因素[1-3]。

高脂血癥預防及治療藥物研究有希望減輕ASCVD 給人類帶來的痛苦,降低疾病負擔。建立理想的降血脂評價體系是研究降血脂藥物首要且重要的一環。常用的降血脂效果評價體系包括建立降血脂動物模型和降血脂體外評價體系[4]。高脂飼料喂養建立的高血脂動物模型符合人類高血脂癥形成特點[5],同時選取SD 大鼠作為模型動物具有成本低、易于操作、穩定性好、取血量大等優點[6],故用高脂飼料喂養SD 大鼠常用于高血脂動物模型的建立。

王燕萍等[7]研究探討了通過高脂飲食喂養SD大鼠4～8 周成功構建高血脂模型,發現造模過程中大鼠血脂水平出現“升高-適應-升高”的內調節過程,4～8 周的高脂飲食不會引起主動脈結構改變但可以誘發大鼠出現中度至重度脂肪肝,但該方法造模時間較長,不適宜大規模推廣。2012年,國家食品藥品監督管理局發布的“輔助降血脂評價方法”[8]中提出:建議使用高脂飼料喂養大鼠1～2 周建立高血脂模型,鄭立新等[9]報道使用該方法推薦的飼料喂養大鼠7 d 后可成功建立混合型高脂模型,由于不同實驗系統環境差別較大、在該方法推薦的時間范圍構建的動物模型血液指標可能存在波動、且存在用該方法構建的高脂模型是否會引起動物組織器官出現病理性改變等問題,本研究旨在通過使用高脂飼料喂養SD 大鼠兩次建立高脂血癥模型,比較不同造模時間動物血液檢測指標及肝形態的變化規律,初步探討模型的建立原理,為現行“輔助降血脂評價方法”推廣及應用提供證據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠,8 周齡共144 只,體重(200±20)g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]。實驗動物的飼養和實驗過程均在湖南省職業病防治院的屏障環境中完成[SYXK(湘)2017-0001]。動物飼養環境:溫度22℃～26℃,相對濕度56%～70%,12 h 明暗交替。研究方案經湖南省職業病防治院GLP 毒理實驗室實驗動物福利與倫理委員會審核通過(JZ03020180008),實驗過程中按照實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

血清總膽固醇檢測試劑盒(批號0119011)、甘油三酯檢測試劑盒(批號1218071)、高密度脂蛋白-膽固醇檢測試劑盒(批號1018072)購自四川新健康成生物股份有限公司;低密度脂蛋白-膽固醇檢測試劑盒(批號1806071119),購自美康生物試劑。日立-7600 全自動生化分析儀;湘鷹TD6-WS 離心機;德國蔡司Axio Lab.A1 系統顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 飼料

維持飼料、模型飼料均由北京科澳協力飼料有限公司提供。模型飼料配方[10]:49.3%維持飼料、20.0%蔗糖、15%豬油、12.5%酪蛋白、1.2%膽固醇、1.3%磷酸氫鈣、0.5%石粉、0.2%膽酸鈉。

1.3.2 實驗動物分組

大鼠于屏障系統下喂飼維持飼料觀察5 d。造模兩次,每次造模選用72 只動物,使用隨機數字法將大鼠分成模型組和對照組,模型組60 只動物,對照組12 只。動物按組別群養,4 只/盒,自由進食及飲水。本文將實驗動物分組當天定義為第0 天。

1.3.3 飼料給予

模型組大鼠給予模型飼料,對照組大鼠給予維持飼料,飼料不限量。

1.3.4 動物體重測量

第一次造模于第0 天,第7 天對動物進行稱重;第二次造模于第0 天、第7 天、第13 天對動物進行稱重。計算動物體重增長率(體重增重/實驗結束時體重×100%)。

1.3.5 血液生化指標測定

兩次造模分別于給予模型飼料后第8 天及第14 天進行不禁食采血。采血前使用大鼠固定板對動物進行固定,使用一次性注射器(2.5 mL)經頸靜脈竇采血。全自動生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)。

1.3.6 組織病理學檢查

股動脈放血處死動物,取肝用福爾馬林溶液固定,用刀片切取3～5 mm 邊緣齊整的組織經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、組織切片、常規脫蠟、HE 染色、脫水及封片后,在光學顯微鏡下觀察、攝像。

1.4 統計學方法

采用SPSS(V20.0)對各項檢測數據繪制Q-Q圖、計算偏度值、峰度值和標準誤,判斷其是否服從正態分布。計算Pearson 相關系數r并進行分級。當r的絕對值大于等于0.7 時,兩變量為高度相關;當r的絕對值大于等于0.4,小于0.7 時,兩變量為中度相關;當r的絕對值小于0.4 時,為低度相關[11]。計量資料采用平均數±標準差()表示,組間差異采用t檢驗進行比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 正態性分析

通過繪制Q-Q 圖以及綜合各組數據分布的偏度值、峰度值和標準誤對數據資料進行正態性分析,動物實驗前后體重、體重增長率及血液生化指標測定結果(TC、TG、LDL-C、HDL-C)均服從正態分布。

2.2 體重及血液生化指標的測定

記錄第一次造模第0 天和第7 天以及第二次造模第0 天、第7 天和第13 天動物體重,計算造模結束時動物體重增長率,檢測造模結束后大鼠血脂水平并進行統計,結果詳見表1、表2。

表1 第一次造模(8 d)動物體重及血液生化指標測定結果Table 1 Results of body weight and blood biochemical indexes in the first modeling (8 days)

表2 第二次造模(14 d)動物體重及血液生化指標測定結果Table 2 Results of body weight and blood biochemical indexes in the second modeling (14 days)

2.3 單次造模模型組與對照組數據比較

第一次造模,模型組與對照組動物第0 天體重差異無統計學意義(P>0.05)。造模第7 d,模型組動物體重低于對照組,差異有統計學意義(P<0.01);模型組TC、TG、LDL-C 值均高于對照組,模型組HDL-C 值低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.01)。

第二次造模,模型組與對照組動物體重不同時間點比較差異均無統計學意義(P>0.05);模型組TC、TG、LDL-C 值均高于對照組,模型組HDL-C 值低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.01)。

2.4 兩次造模模型間數據比較

兩次造模對照組之間TC、TG、LDL-C、HDL-C 值差異均無統計學意義(P>0.05)。兩次造模模型組之間TC、LDL-C 差異無統計學意義(P>0.05);造模14 d 模型組TG 均值為造模8 d 模型組均值的137.8%,造模14 d 模型組HDL-C 均值為造模8 d模型組均值的81.5%,差異有統計學意義(P<0.01)。

2.5 各項檢測指標相關性分析

結果顯示:兩次造模對照組動物TC/LDL-C、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C 均呈正相關(P<0.01);模型組動物TC/TG、TC/LDL-C、TG/LDL-C、TG/體重增長率均呈正相關(P<0.05 或P<0.01),TG/HDL-C 均呈負相關(P<0.01)。其余檢測指標無相關性(P>0.05)。相關程度詳見表3、表4。

2.6 肝組織病理學檢查結果

正常對照組可見肝組織結構正常,肝竇清晰可見,肝索排列整齊,肝細胞核位于細胞中央,細胞質豐富。

給予模型飼料8 d 后,肝出現彌漫性水樣改變,肝竇受壓,肝索尚正常,肝細胞胞漿腫大疏松化。

給予模型飼料14 d 后,肝出現彌漫性水樣改變伴輕度脂肪變性(脂變程度小于1/3),肝竇變窄,肝索排列紊亂,肝細胞胞漿腫大疏松化、出現小脂滴。詳見圖1。

3 討論

近年來,我國對于化學物質誘導形成高血脂動物模型的研究有諸多報道,研究發現不同的動物品系、年齡、體重、飼養環境,不同高脂飼料配方以及采用不同檢測方法等影響因素對建模成功時間以及檢測指標結果有較大影響[12-15]。因此,對于保健品和藥物研發者而言,針對各種研究及實踐的需要篩選出合適的高血脂動物模型,并依此在國內制定完善的標準非常必要且迫切。對于第三方檢測實驗室而言,掌握模型的特點和變化規律,及時建立規范化的歷史背景值參考體系,對于準確評估實驗結果,得出正確的實驗結論有重要意義。

表3 兩次造模對照組動物體重增長率及血液生化指標相關性分析Table 3 Correlation analysis of body weight growth rate and blood biochemical indexes in two control groups

表4 兩次造模模型組動物體重增長率及血液生化指標相關性分析Table 4 Correlation analysis of body weight growth rate and blood biochemical indexes in two modeling groups

圖1 大鼠肝組織病理學檢查結果Note.A,Control group.B,Control group.C,Modeling for 8 days.D,Modeling for 8 days.E,Modeling for 14 days .F,Modeling for 14 days.Figure 1 Histopathological examination of rat liver

本研究比較了短期內依照相同標準在相同環境條件下進行的兩次造模,除動物批次及造模時間不一致,其余研究因素均相同。研究的主要目的在于檢驗在1～2 周時間內,本實驗室是否可以依據標準建立穩定可靠的降血脂大鼠模型,為建立實驗室歷史背景值提供參考。

據報道,當TG>4.52 mmol/L 時,Friedewald 公式計算法、改良Friedewald 公式計算法及新公式計算法均不能準確估算LDL-C 值[16]。本研究中,兩次造模模型組TG>4.52 mmol/L 的動物數量分別占總數的31%和47%,故高血脂模型LDL-C 值一律采用直接測定法獲得。

兩次造模模型組動物血清TC、TG、LDL-C 值均高于對照組,模型組HDL-C 值均低于對照組;造模時間延長,TG 水平增高,HDL-C 水平降低。以上結果表明兩次造模SD 大鼠高脂血癥模型均建立成功,且均為混合型高脂血癥模型[7]。

本研究中模型組與對照組動物TC 及LDL-C 結果基本平行,且兩個指標在模型組和對照組中均體現出較強的相關性。攝入高脂飼料后,模型組動物TG 與TC、LDL-C、HDL-C、體重增長率出現不同程度相關,可能因為TG 值較其它指標更易受飲食或時間等因素影響;而模型組HDL-C 與TC、LDL-C 相關性消失,或可部分歸因于高TG 血癥與HDL-C 降低的相關性,有待進一步研究;經比較,兩次造模各項指標相關性趨勢高度一致。以上結果與諸駿仁等[2]的報道基本相符。結果顯示,模型組動物體重增長率僅與TG 值存在相關性且呈弱相關,說明該方法所用飼料可明顯改變動物血脂水平,但對動物體重影響較小。

當造模時間為8 d 時,模型組動物第7 天體重低于對照組,差異有統計學意義(P<0.01);當造模時間為14 d 時,模型組與對照組動物體重不同時間點比較差異雖無統計學意義(P>0.05),但第7 天體重絕對值低于對照組(P=0.088)。基于此現象,如果研究中動物體重為模型應用階段重要分析指標,研究者可通過在造模階段增加動物數、造模結束后將體重納入篩選指標等手段,盡可能消除因造模產生的動物體重差異。鄭立新等[9]認為動物體重波動可能因為動物脂代謝紊亂、形成脂肪肝從而影響動物攝食所致;而胡慧明等[17]提出因飼料具有高糖、高脂的特點,從而導致短期內部分動物不適應產生厭食。如果模型組動物的飲水量、攝食量低于對照組,說明短時間內可能因為飼料口感等原因導致動物的攝食量降低從而影響動物生長;如果模型組動物的飲水、攝食情況與對照組比較無差異,說明該飼料并不會引起動物厭食,動物體重波動可能來自代謝紊亂。因本研究未對動物飲水及進食情況進行監測,故無法準確判斷動物體重波動原因。

病理組織學結果表明,使用高脂飼料喂養動物8 d 和14 d 均可誘發肝病理性改變,且病變程度與造模時間呈正相關。證明短時間內大量使用含有膽固醇、蔗糖、豬油、膽酸鈉的飼料喂養動物可誘發急性肝損傷從而形成脂代謝紊亂。

綜上所述,本研究所用的造模方法在8～14 d內均可建立SD 大鼠混合型高脂血癥模型,該方法建立的模型具有造模時間短、關鍵指標穩定以及重現性好的特點。可廣泛應用于飲食因素對血脂影響的研究、輔助降血脂功能保健食品以及調血脂藥物的開發應用。本研究結果既可為本實驗室相似研究提供依據,又可為將來制定參考值范圍以及相關標準提供參考。