不同時間離心運動對大鼠比目魚肌和趾長伸肌損傷的影響及炎性機制研究

侯改霞李騰沖蔣昊圻梁學三李露豪薛俊杰付素煥

(河南大學體育學院,河南開封 475001)

骨骼肌損傷是運動損傷中最常發生的一種軟組織創傷,占運動損傷的40%以上[1]。在骨骼肌損傷治療的研究中,骨骼肌損傷動物模型的可靠性、適用性和可行性與實驗結果的科學性密切相關。下坡跑(離心運動)骨骼肌損傷模型常常被用以研究骨骼肌運動性損傷[2]。在復制下坡跑(離心運動)骨骼肌損傷模型時,動物跑臺坡度一般采用-16°,但運動時間及模型的取材部位等問題還存在爭議。已有研究認為,1 周連續的離心運動與1 次離心運動相比,骨骼肌損傷無積累現象[3],但金其貫等[4]研究則認為短時間內連續大強度的離心運動可造成骨骼肌損傷的累積。關于取材部位,有的研究在比目魚肌[5],有的研究在趾長伸肌[6]。因此,復制下坡跑(離心運動)骨骼肌損傷模型的方法還有待于進一步的驗證和考究,為骨骼肌運動損傷研究的開展提供模型基礎。

本課題擬通過不同時間的大鼠離心運動,復制大鼠骨骼肌損傷模型,通過檢測骨骼肌損傷大鼠的血清和骨骼肌的相關指標,來觀察、對比不同方法復制的大鼠骨骼肌損傷模型的特點,為骨骼肌運動損傷的研究提供可靠、實用的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Wister 大鼠24 只(SPF 級,8 周齡,體重290～320 g),購自北京斯貝福生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010]。大鼠飼養于河南大學體育學院運動人體科學實驗室專用動物房內[SYXK(豫)2016-0006],大鼠分籠喂養,每籠4 只,自然晝夜節律變化,自由進食。室溫(23±2)℃,相對濕度40%～60%。普通飼料喂養,飼料由北京斯貝福生物技術有限公司配制。本實驗方案通過河南大學生物醫學科研倫理委員會審核批準(HUSOM -2019044),在實驗的過程中嚴格遵循實驗動物的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

乳酸脫氫酶(LDH)(批號20190617)和肌酸激酶(CK)(批號20191007)均購自南京生物工程研究所;試劑盒RNA 提取液、QRT-PCR 引物、HE 染液均購自武漢賽維爾生物科技公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、中性樹膠均購自國藥集團化學試劑有限公司;D3024R 臺式高速冷凍型微量離心機(DragonLab);Stepone plus 熒光定量PCR 儀(ABI)、JJ-12 J 脫水機與JB-P5 包埋機(武漢俊杰電子有限公司);RM2016病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);Nikon Eclipse E100 正置光學顯微鏡(日本尼康)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及訓練方法

參照文獻[6]方法并稍加改進建立骨骼肌損傷模型,采用動物跑臺運動,下坡跑(離心運動),跑臺坡度-16°。雄性Wister 大鼠適應性喂養1 周后,隨機分為3 組:安靜對照組(A 組)、一次離心運動損傷組(1T 組)、一周離心運動損傷組(1 W 組),每組8 只。A 組飼養條件與運動組相同,不運動。1 W組先進行1 周適應性訓練,再進行1 周正式訓練。1周適應性訓練方案為:第1、2 天,跑臺坡度為0°,速度為16 m/min,每天訓練10 min;第3、4 天,跑臺坡度為-5°,速度為16 m/min,每天訓練15 min;第5、6天,跑臺坡度為-10°,速度為16 m/min,每天訓練30 min;第7 天休息。1 周正式訓練方案為:第1、2 天,跑臺坡度為-16°,速度為20 m/min,每天訓練60 min;第3～4 天,跑臺坡度為-16°,速度為20 m/min,每天訓練90 min;第5～6 天,跑臺坡度為-16°,速度為20 m/min,每天訓練120 min;第7 天,跑臺坡度為-16°,速度為22 m/min,訓練120 min。1T 組訓練方案為:第1～6 天訓練方法同1 W 組的適應性訓練方案;第7 天,跑臺坡度為-16°,速度為22 m/min,訓練120 min。

1.3.2 動物取材和指標檢測

最后一次訓練結束后24 h,所有大鼠過夜禁食12 h 后,稱重,腹腔麻醉,取材。腹主動脈采血,3000 r/min 離心20 min,取血清置于-80℃冰箱保存以備LDH、CK 檢測。取各組大鼠右下肢同一部位比目魚肌、趾長伸肌置于4%多聚甲醛中固定以備HE 染色切片的制作。取各組大鼠左下肢同一部位趾長伸肌、比目魚肌置于-80℃冰箱保存以備各指標熒光定量PCR(QRT-PCR)的檢測。

1.3.3 骨骼肌HE 染色切片的制作及觀察

固定好的比目魚肌和趾長伸肌經過脫水、浸蠟、包埋、切片4 μm;石蠟切片脫蠟至水,蘇木素染色,伊紅染色,依次脫水,中性樹膠封片;光學顯微鏡觀察,圖像采集分析。骨骼肌細胞核呈藍色、細胞質呈紅色。

1.3.4 熒光定量PCR(QRT-PCR)檢測

分別取0.1 g 比目魚肌和0.1 g 趾長伸肌,進行總RNA 抽提,檢測RNA 純度與濃度。按Real-time qPCR 試劑盒說明書進行Real-time qPCR。采用Primer 5.0 設計目的基因,Blast 軟件檢測引物特性,Oligo 7.37 選擇最佳引物。具體引物信息如表1。PCR 擴增:預變性(95℃,10 min),循環(40 次)(95℃,15 s→60℃,60 s),熔解曲線(60℃→95℃,每15 s 升溫0.3℃)。GAPDH 作為內參,根據公式2-△△CT計算目的基因的相對表達量。

表1 各指標qRT-PCR 引物信息Table 1 qRT-PCR primer information of each index

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 離心運動對各組大鼠血清LDH、CK 水平的影響

由表2 可知,與A 組相比,1T 組和1 W 組大鼠血清CK、LDH 水平均顯著升高(P<0.05 或P<0.01);1 W 組大鼠血清CK、LDH 水平顯著低于1T組(P<0.05 或P<0.01)。

2.2 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達的影響

如圖1 所示,A 組大鼠的比目魚肌和趾長伸肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達水平無差異(P>0.05);1T 組大鼠的比目魚肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達水平顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.01);1T 組大鼠的趾長伸肌TLR4 mRNA 表達水平顯著高于A 組大鼠的趾長伸肌(P<0.01),MyD88 mRNA 表達水平顯著低于1T 組大鼠的比目魚肌(P<0.01);1 W 組大鼠的比目魚肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達水平顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.01),TLR4 mRNA 表達水平顯著低于1T組大鼠的比目魚肌(P<0.05);1 W 組大鼠的趾長伸肌TLR4 mRNA 表達水平顯著高于A 組大鼠的趾長伸肌(P<0.01),顯著低于1T 組大鼠的趾長伸肌(P<0.01);1 W 組大鼠的趾長伸肌MyD88 mRNA 表達水平顯著低于1 W 組大鼠的比目魚肌(P<0.01)。

2.3 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達的影響

如圖2 所示,A 組大鼠的比目魚肌和趾長伸肌的NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達均無差異(P>0.05);1T 組大鼠的比目魚肌NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達均顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.05 或P<0.01);1T 組大鼠的趾長伸肌NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達顯著低于1T 組大鼠的比目魚肌(P<0.01);1 W 組大鼠的比目魚肌NLRP3 mRNA 表達顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.01),1 W 組大鼠的趾長伸肌NF-κB mRNA 表達顯著低于A 組大鼠的趾長伸肌和1 W 組大鼠的比目魚肌(P<0.05),1 W 組大鼠的趾長伸肌NLRP3 mRNA 表達顯著低于1 W 組大鼠的比目魚肌(P<0.01)。

2.4 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達的影響

如圖3 所示,A 組大鼠的比目魚肌和趾長伸肌的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達均無差異(P>0.05);1T 組大鼠的比目魚肌TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達均顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.05);1T 組大鼠的趾長伸肌IL-1β mRNA 表達顯著高于A 組大鼠的趾長伸肌(P<0.05)。

2.5 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌顯微結構的影響

如圖4 所示,骨骼肌細胞HE 染色細胞核呈藍色,細胞質呈紅色。各組大鼠比目魚肌中毛細血管數量多于趾長伸肌。與A 組相比,1T 組大鼠的比目魚肌和趾長伸肌肌細胞間有稍許炎癥浸潤,細胞間間隙增大,但這種變化比目魚肌更明顯。與A 組相比,1T 組大鼠的比目魚肌和趾長伸肌的顯微結構變化不大。

3 討論

3.1 不同離心運動時間對大鼠血清指標的影響

研究表明[7-9],骨骼肌損傷會導致機體血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)活性的急劇升高。本研究結果顯示,與A 組相比,1T 組和1 W組大鼠血清CK、LDH 水平均顯著升高(P<0.05 或P<0.01);1 W 組大鼠血清CK、LDH 水平顯著低于1T 組(P<0.05 或P<0.01)。提示,與一次大強度離心運動相比,一周的離心運動雖也造成了骨骼肌細胞膜的通透性增大,骨骼肌內CK、LDH 向外逸流增多,但對大鼠骨骼肌損傷并沒有表現出疊加作用。本結論與Chen 等[3]的研究結果一致,原因可能與肌肉對離心運動的“適應效應”最早可能發生在第一次離心運動后24 h,持續強化的離心訓練對肌肉的損傷和炎癥沒有加重作用。但金其貫等[4]研究則認為連續的離心運動可使骨骼肌纖維的損傷產生一定的累加作用。因此,關于不同離心運動時間對骨骼肌損傷的影響及其機制還需進一步的研究。

表2 離心運動對各組大鼠血清LDH、CK 水平的影響()Table 2 Effects of eccentric exercise on serum LDH and CK levels of rats in each group

表2 離心運動對各組大鼠血清LDH、CK 水平的影響()Table 2 Effects of eccentric exercise on serum LDH and CK levels of rats in each group

注:與安靜組A 組比較,?P<0.05,??P<0.01;與一次離心運動組(1T 組)比較,#P<0.05,##P<0.01。Note.Compared with Group A,?P<0.05,??P<0.01.Compared with Group(1T),#P<0.05,##P<0.01.

圖1 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達的影響Note.The indexes of soleus muscle and extensor digitorum longus of rats in the same group were compared.The indexes of soleus muscle of rats in different groups were compared.The indexes of extensor digitorum longus between different groups were compared.Compared with soleus muscle of Group A,?P<0.05,??P<0.01.Compared with extensor digitorum longus of Group A, ΔP<0.05,ΔΔP<0.01.Compared with soleus muscle of Group(1T),#P<0.05,##P<0.01.Compared with extensor digitorum longus of Group(1T),※P<0.05,※※P<0.01.Compared with soleus muscle of Group(1 W), $P<0.05, $ $P<0.01.The same as below.Figure 1 Effects of eccentric exercise on TLR4 mRNA and MyD88 mRNA expression in soleus and extensor digitorum longus in each group

圖2 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達的影響Figure 2 Effects of eccentric exercise on the expression of NF -κ B mRNA and NLRP3 mRNA in soleus and extensor digitorum longus in each group

圖3 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達的影響Figure 3 Effects of eccentric exercise on the expression of TNF-α mRNA and IL-1β mRNA in soleus and extensor digitorum longus in each group

圖4 離心運動對各組大鼠比目魚肌和趾長伸肌顯微結構的影響Figure 4 Effects of eccentric exercise on the microstructure of soleus muscle and extensor digitorum longus in each group

3.2 不同時間的離心運動對大鼠比目魚肌和趾長伸肌TLR4/MyD88 信號通路及其下游相關炎癥因子的影響

Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是Toll樣受體家族的重要成員之一,TLR4 及其信號通路可激活機體固有免疫系統。TLR4/MyD88(myeloid differentiation factor-88)是TLR4 的主要信號通路?；就緩饺缦耓10-13]:TLR4 被激活后,首先形成LPS/TLR4/MD2 復合物,然后招募接頭蛋白MyD88,從而進一步激活NF-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),刺激炎癥細胞合成和釋放 IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等前炎性因子的表達,進一步引起機體的炎癥反應和組織損傷。

Nod 樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)也是機體固有免疫系統的識別受體,是一種重要的炎癥調節因子。TLR4 屬于膜表面受體,NLRP3 是胞質內受體。TLR4/MyD88 信號通路激活NF-κB 后,介導無活性IL-1β 前體(pro-IL-1β)的產生,NLRP3 活化可將pro-IL-1β 剪切為活化的IL-1β,從而介導炎癥反應[14]。同時也有研究證明,NF-κB信號通路具有調節NLRP3 炎癥小體活化的作用[15]。由此可見,NLRP3 與TLR4/MyD88/NF-κB 介導的炎癥反應之間存在反饋調節網絡,它們相互協作,共同發揮作用。

本研究結果表明,一次離心運動和一周離心運動對大鼠骨骼肌均造成了一定程度的損傷與炎癥。相對于一周離心運動來說,一次大強度離心運動對大鼠骨骼肌造成的損傷更嚴重,炎癥因子的表達水平更高,且大鼠比目魚肌的損傷程度比趾長伸肌更大。一次離心運動組(1T)比目魚肌TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、TNF-α、IL-1β 基因表達均顯著上升,而且比目魚肌相關炎癥因子的表達顯著高于趾長伸肌。研究表明,骨骼肌炎癥與TLR4/MyD88 信號通路激活有密切關系。Kwon 等[16]將小鼠后肢去負荷14 d,野生型(WT)小鼠的骨骼肌表現為葡萄糖攝取受損、肌肉胰島素信號異常,同時骨骼肌TLR4、NF-κB、炎癥因子表達上升,而MyD88(-/-)小鼠卻沒表現出此現象。離心運動會引起人體骨骼肌相關炎性因子表達的變化[17-19],這可能與離心運動可激活機體TLR4/MyD88 信號通路相關。研究表明[20-21],急性的離心運動會激活男、女外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)TLR4/MyD88 信號通路,引起NF-κB、IL-1、TNF-α 的表達增多。過度的離心運動也會導致短暫的下丘腦炎癥,可導致過度運動小鼠的體重和攝食的減少[22]。老年人髖部骨折引起的股四頭肌炎癥同樣與TLR4/MyD88 信號通路的激活有關,3 個月的運動康復訓練,能夠降低TLR4/MyD88 信號通路的活性,降低與骨骼肌炎癥相關的基因表達[23]。同樣,離心運動會導致大鼠骨骼肌中TLR4、MyD88 表達增多,NF-κB、TNF-α、IL-1β 等炎性因子的表達上升,抗炎藥的使用可以改善離心運動大鼠骨骼肌的炎癥狀態[24]。因此,本研究所采用的離心運動方式造成的大鼠骨骼肌的損傷和炎癥,可能與TLR4/MyD88 信號通路的激活密切相關,至于同樣的離心運動方式,卻對大鼠比目魚肌和趾長伸肌的損傷和炎癥因子表達的影響不同,具體機制還需要進一步的研究。